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(無題) 削除/引用 No.4213-16 - 2015/06/24 (水) 01:35:24 - western おお様 >見たい細胞に発現するマーカーをinternal controlにとることはかのうでしょうかねぇ。。。 >たとえば筋肉だったらミオシン重鎖をつかったりします。 論文ではinternal　controlにNa+/K+-ATPaseが用いられていたりします。

(無題) 削除/引用 No.4213-15 - 2015/06/24 (水) 01:26:23 - おお >[Re:13] westernさんは書きました : > おお様 > 輪状の小腸にハサミを入れて開き、スクレーパーを用いて柔毛部分をかきとっていますが、底部に存在する平滑筋層がどれほどコンタミしているのかは現状ではわかりません。(対象タンパクを取り扱った論文では軒並み柔毛をscrapeしている旨が記述されております) 見たい細胞に発現するマーカーをinternal controlにとることはかのうでしょうかねぇ。。。 たとえば筋肉だったらミオシン重鎖をつかったりします。

(無題) 削除/引用 No.4213-14 - 2015/06/24 (水) 00:52:39 - western み様 >SDS,urea,還元剤入りのﾊﾞｯﾌｧーと混ぜる前に定量した方が良い。 >おそらく今の方法では正確な定量が出来ていない気がする。たとえ100倍希釈し> たものを測定していると言っても。 >それとホモジナイズした後、しばらく低温で撹拌抽出でもしたらどう？ ご指摘ありがとうございます。 SDS,urea,還元剤入りのﾊﾞｯﾌｧーと混ぜる前にBCAを行ってみます。 低温での撹拌抽出についてですが、ホモジナイズ直後に遠心を行ったものと、on ice 20min(5minおきに軽くvortex)で抽出を行ったものでは前者のほうが標的タンパクは見やすい結果となっておりました。

(無題) 削除/引用 No.4213-13 - 2015/06/24 (水) 00:46:51 - western おお様 >アクチンのしぐなるでどうしても200ugでやりたかったら、一次、二次抗体の量をなるだけ下げて調整してください。 ただ200ugだと相当濃いライせーとになると思うのですが、それだとやはり抽出がうまくいっているかとかばらついているかとか気になります。 またそう言った濃い溶液だとサンプルバッファー中でボイルしても一部蛋白が沈殿することがあります。 必要な組織をかきとっているようですが、その組織の均一性とか、いろいろな物が混じっていてもいいかもしれませんが、サンプル間での混じり方の違いとかは心配しなくていいでしょうか? あとものは200ugのせないと検出できないでしょうか?意外に下げてもオーバーロードにならないぶん検出感度が上がったりすることもあると思います。 >membraneはPVDFでしょうか? ライセートの濃度を下げ、50μgほどにタンパク量を下げたいと思います。 membraneにはPVDFを用いています、またご指摘の通り組織をかきとった際の均一性は多少ひっかかっている部分があります。 輪状の小腸にハサミを入れて開き、スクレーパーを用いて柔毛部分をかきとっていますが、底部に存在する平滑筋層がどれほどコンタミしているのかは現状ではわかりません。(対象タンパクを取り扱った論文では軒並み柔毛をscrapeしている旨が記述されております)

(無題) 削除/引用 No.4213-12 - 2015/06/24 (水) 00:38:37 - western 中年様　ご指摘ありがとうございます。 >飽和したアクチンのシグナルがローディングコントロールになっていないことに私も一票。 >メンブレン上の全タンパク質をCBBやポンソーなどで染めだして、少なくとも見た目に差がないことを確認してみてはどうですか。 転写後、ポンソーで染めてみます。

(無題) 削除/引用 No.4213-11 - 2015/06/24 (水) 00:37:04 - western gg様 >総タンパク質200 ugは、アクチンの検出には多すぎです。 >数秒で検出してもシグナルが飽和しているため、一般的には比較は不可能です。 >飽和したシグナルでは、ローディングコントロールにはなり得ません。 >ちょっと指導教官の認識を疑ってしまいます。 総タンパク質を50μg程まで下げて抗体濃度等検討してみます。 >一度マニュアルをよく読む事をお勧めします。 >タンパク質濃度の測定法によって許容できる試薬の濃度があり、それぞれのマ >ニュアルに必ず記載があります。100-200倍希釈ということですが、PBSや水で希釈して測定しているなら問題ないですが、SDSやUreaを含んでいるバッファーで希釈しているなら、正確なタンパク質濃度は測定できていません。 D.W.を用いていたのでその点は大丈夫でしたが、ご指摘ありがとうございますマニュアルをもう一度読んでみます。

(無題) 削除/引用 No.4213-10 - 2015/06/24 (水) 00:02:24 - おお membraneの種類をきいたのは、あまり多いとのりきらない可能性もあるかもと思ったのです。キャパいないでものりやすいものとのりにくいものが共存すると、はじき出されたりするようなきもするし。PDVFだと安心といっているわけではないのですが、比較的多くのせれるので、、、

(無題) 削除/引用 No.4213-9 - 2015/06/23 (火) 23:54:48 - み SDS,urea,還元剤入りのﾊﾞｯﾌｧーと混ぜる前に定量した方が良い。 おそらく今の方法では正確な定量が出来ていない気がする。たとえ100倍希釈したものを測定していると言っても。 それとホモジナイズした後、しばらく低温で撹拌抽出でもしたらどう？

(無題) 削除/引用 No.4213-8 - 2015/06/23 (火) 18:32:32 - おお アクチンのしぐなるでどうしても200ugでやりたかったら、一次、二次抗体の量をなるだけ下げて調整してください。 ただ200ugだと相当濃いライせーとになると思うのですが、それだとやはり抽出がうまくいっているかとかばらついているかとか気になります。 またそう言った濃い溶液だとサンプルバッファー中でボイルしても一部蛋白が沈殿することがあります。 必要な組織をかきとっているようですが、その組織の均一性とか、いろいろな物が混じっていてもいいかもしれませんが、サンプル間での混じり方の違いとかは心配しなくていいでしょうか? あとものは200ugのせないと検出できないでしょうか?意外に下げてもオーバーロードにならないぶん検出感度が上がったりすることもあると思います。 membraneはPVDFでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.4213-7 - 2015/06/23 (火) 18:20:03 - 中年 飽和したアクチンのシグナルがローディングコントロールになっていないことに私も一票。 メンブレン上の全タンパク質をCBBやポンソーなどで染めだして、少なくとも見た目に差がないことを確認してみてはどうですか。

(無題) 削除/引用 No.4213-6 - 2015/06/23 (火) 17:59:07 - gg >[Re:5] westernさんは書きました : > 200μg流しています。 > 目的タンパクの分子量が145kDaなので、転写後のメンブレンの下部を切り取り > actinの検出に用いています、そのためフィルムカセットに挟む時間は数秒です。(actinの検出には大過剰なのは理解しており、別レーンで検出を行いたいところですが指導教員より「別レーンで検出してもloading controlの意味がない」と言われております) 総タンパク質200 ugは、アクチンの検出には多すぎです。 数秒で検出してもシグナルが飽和しているため、一般的には比較は不可能です。 飽和したシグナルでは、ローディングコントロールにはなり得ません。 ちょっと指導教官の認識を疑ってしまいます。 > SDS、Urea濃度の許容範囲については存じ上げませんが、通常100〜200倍希釈後のサンプルを用いてBCAを行っています。 一度マニュアルをよく読む事をお勧めします。 タンパク質濃度の測定法によって許容できる試薬の濃度があり、それぞれのマニュアルに必ず記載があります。100-200倍希釈ということですが、PBSや水で希釈して測定しているなら問題ないですが、SDSやUreaを含んでいるバッファーで希釈しているなら、正確なタンパク質濃度は測定できていません。

(無題) 削除/引用 No.4213-5 - 2015/06/23 (火) 17:17:35 - western gg様。 200μg流しています。 目的タンパクの分子量が145kDaなので、転写後のメンブレンの下部を切り取り actinの検出に用いています、そのためフィルムカセットに挟む時間は数秒です。(actinの検出には大過剰なのは理解しており、別レーンで検出を行いたいところですが指導教員より「別レーンで検出してもloading controlの意味がない」と言われております) SDS、Urea濃度の許容範囲については存じ上げませんが、通常100〜200倍希釈後のサンプルを用いてBCAを行っています。

(無題) 削除/引用 No.4213-4 - 2015/06/23 (火) 17:04:46 - gg アクチンの検出でも200 ugロードしてますか？ BCA測定の際は、SDSやUreaを許容範囲まで希釈していますか？

(無題) 削除/引用 No.4213-3 - 2015/06/23 (火) 16:52:49 - western 返信ありがとうございます。 組織:マウス小腸3cm分の柔毛をscrapeしたもの ゲルにロードしているタンパク量:200μg (目的タンパクの発現量が極端に少ないため) 抽出条件: 50mM Tris-HCl pH8.0 150mM NaCl 2mM MgCl2 0.1% SDS 1.5% NP-40 0.5%デオキシコール酸 1mM PMSF complete(protease inhibitor) lysis bufferは上記です bufferを1.5mL組織に加える ↓ homoginize ↓ 13200rpm,10分,4℃遠心 ↓ 0.6mL上清を回収 ↓ 膜タンパク可溶化bufferを0.6mL加える ↓ BCA ↓ loading bufferを加えboil　という流れです 膜タンパク可溶化bufferの組成は以下です 62.5mM Tris-HCl(pH6.8) 15%SDS 8M尿素 100mMジチオスレイトール 上記組成、抽出方法は先行文献を参考にしています。

(無題) 削除/引用 No.4213-2 - 2015/06/23 (火) 16:32:13 - おお いろんな可能性があると思いますけど、いっぺんに全部各余裕がないので、まず、蛋白抽出がぶれている可能性。抽出条件、蛋白濃度、組織などできる範囲で開示されてはどうでしょうか?

western blotで同じgenotype間でのタンパク発現量が揃わない 削除/引用 No.4213-1 - 2015/06/23 (火) 16:19:46 - western いつもお世話になっております。 現在western blotにより膜タンパクのタンパク発現量を見ています。 実験に用いているKOマウスは現在検出を試みている膜タンパクのKOではなく、関係のないタンパクをKOしています。 定量のため、WTのマウス3匹、KOのマウス3匹の組織からタンパクを抽出しwestern blotを行っています。 しかし、loading controlとして用いているactinの量が揃っているのにも関わらず、同じgenotypeであるWT同士、KO同士でのタンパク発現量がばらついてしまいます。 解決法についてご助言頂けますと幸いです。

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