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ありがとうございました 削除/引用 No.4210-4 - 2015/06/23 (火) 17:48:52 - だるまさん コメントありがとうございました。 確かにWBで蛋白質レベルで確認するのが一番良く、いずれにせよ最終的にはそれが必須だと思うのですが、殆ど研究されていない遺伝子で良い抗体がありません。今、ペプチド抗体を作製中ですが、何とか塩基配列レベルでindelを確認したいと思っています。多少お金は掛かりますが、数クローンずつ選択して配列を読んでいきます。

(無題) 削除/引用 No.4210-3 - 2015/06/23 (火) 17:31:02 - 独り言 Crisprでindelを入れて、遺伝子ノックアウトすることが目的なのであれば、クローン化したらウエスタンでタンパク質発現見たほうが確実です。T7E1アッセイでは両アレルがKOなのか判断するのは難しいし、シークエンシングはお金かかるし。ウエスタンなら一気に全部のクローン見て、KOを選べばいいだけ。

(無題) 削除/引用 No.4210-2 - 2015/06/23 (火) 16:37:20 - mon 確率を計算すれば、（PCRバイアス、クローン化バイアスがないとして） PCR産物由来クローンを3つ塩基配列決定して全てホモだった場合、真はヘテロである確率は、(1/2)^3=1/8、４つなら1/16。 研究室のシークエンシング能力や何個の細胞クローンを同定し今後解析するかにも寄りますが、1次選抜としてPCR産物由来クローンを3つづつ塩基配列決定するのがコストパフォーマンスが良さそうな。次に選抜したものを再度3-5つ追加で読むとか。 注意点として、Indel導入は両アリルで別の配列になる可能性があること(indel-A/indel-B)および、特にがん細胞株の場合アリルが0~1コピーまたは3コピー以上の場合を想定したほうがよいでしょう。

CRISPR-Cas9_Indelの確認について 削除/引用 No.4210-1 - 2015/06/23 (火) 13:11:24 - だるまさん CRISPR-Cas9の系で、ある細胞株の特定遺伝子部位にIndelを導入することを試みました。確認はT7E1アッセイを用いて行い、最終的にIndel導入が確認された細胞プールからシングルセルクローニングを行いました。 ここで質問ですが、最終的にこのように単一クローンにまでした場合、Indel導入の有無はT7E1では確認できないものなのでしょうか？すなわち、仮に両アリルとも全く同じ変異が入った場合には、PCR産物は1種類だけとなり、理論上T7E1アッセイではWTと区別できません（多少長さが違うのでしょうがアガロースゲルでは判別不能です）。また、片方のアリルはWTのままで残った場合と、両アリルで異なる変異が入った場合は、どちらもヘテロ2重鎖とホモ2重鎖が混在するパターンとなり、T7E1では見分けがつかない気がします。結局、単一細胞由来クローンにまでした場合は、PCR産物をクローニングした後、幾つか塩基配列解析を行ってIndelを確認するしかないでしょうか？また、そうだとしたら、一般的にどれくらいの数のPCR産物クローンを解析すれば良いのでしょうか？通常は、単一細胞由来クローンを何種類か取ることになると思うので、そうなるとかなりの数の塩基配列決定を行わないといけないような気がします。 詳しい方がおられたら是非御教授の程宜しくお願いいたします。

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