BioTechnicalフォーラム [FISHで組織標本中の変異細胞を同定する方法]

FISHで組織標本中の変異細胞を同定する方法

No.421-TOPIC - 2012/04/17 (火) 16:52:15 - 日出

組織標本(パラフィンあるいは凍結)において、既知の１塩基置換の遺伝子変異を有する細胞（野生型と変異型のヘテロと仮定）を同定したいと考えています。
RNAの発現がある場合に、FISHでオリゴプローブで検出することを考えてみたのですが、（それ以外に）感度の良い方法などありますでしょうか?
細胞レベルの解像度を保ったままin situでPCRができるといいのですが…
　

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No.421-6 - 2012/08/06 (月) 10:34:08 - ~

Single-nucleotide polymorphism fishで検索すると複数の文献がヒットしますね。

または、その遺伝子の発現が確認されているのであれば、発現したタンパク質について、野生型、変異型をそれぞれ認識する抗体で検出できませんかね。
いいモノクローナル抗体が2つ取れれば可能かと。

(無題)

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No.421-5 - 2012/08/06 (月) 09:51:30 - 日出

>[Re:3] Harmoniaさんは書きました :
> 質問。
> １．「既知の１塩基置換の遺伝子変異を有する細胞」と「変異を有しない野生
> 型の細胞」が混在している組織って、何を想定していますか？
>
> 「野生型と変異型のヘテロ」接合体の個体であれば、どこの細胞でも野生型の
> 遺伝子と変異の遺伝子の両方をもっているはずですが。

後天的な突然変異が一部の細胞に生じ、疾患が発症するという仮説を考えています。
ですから、一部の細胞にのみ変異があり、その細胞ではヘテロな状態になります。
癌をイメージしていただけるといいのですが、私の対象は増殖に関係しない変異を仮定していますので、腫瘍を解析する、あるいはマイクロダイセクションを適用できません。

> ２．なぜ「変異が既知」ですか？

まだ実験を本格的に開始していませんので、仮定の条件です。組織よりmRNA, genomicDNAを抽出後、対象遺伝子をPCRして、それをクローニングすることなく一分子シークエンサーにかけることでスループットを確保しながら、低頻度に存在するかもしれない変異を検出したい（要するにまだ結果はありません）と考えています。その後、変異が実際に特定の細胞で起きていることを証明するために、組織での検出を考えているところです。

ありがとうございました。

(無題)

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No.421-4 - 2012/08/06 (月) 09:45:17 - 日出

４月の質問ですが、まだ解決しておらず（実験を本格化していません）アドバイス、ありがとうございました。

>[Re:2] KENさんは書きました :
> DNAプローブ、RNAプローブだとまず無理だと思います。
> 残るは、LNA, PNA等々を用いシビアな条件でハイブリ。。。
> かとは思いますが、in situですとPNAプローブでも難しいかとおもいます。(PNAプローブは商業ベースの商品でない特注品は、非常にお金もかかりますし。)

> 以下、あくまで私の妄想の世界と思ってお付き合い下さい。
>
> 仮に上記問題が解決したとしても、Mutant型のプローブだけでハイブリさせると、おそらく非特異反応なのかさっぱり分からなくなる気がします。
> よって、競合的にMutant型とWild型の2種類のプローブの混合液を作り、同時にハイブリさせる必要があるかなと。
>
> 思いつく方法としては、Mutant型 probeとwild typeプローブをPNAあたりで作成し、それぞれ別のラベルをし、シビアな条件でハイブリ、発色させれば、発現量によって色が変わるかな。というアイデアがありますが、まあ、うまく行けば儲けもの失敗する気がぷんぷんします。

今考えていることは、mRNA(coding region)に変異がある場合は、その前後の短い部分を組織切片上でin situ PCR（この時点では標識を入れない）して、その後、短いoligo DNA Probe（野生型、変異型）でハイブリして検出するのが一番すっきりするのではないかと考えております。

もう一ついただいた回答にコメントを入れさせていただくつもりですが、組織標本中の一部の細胞にのみ変異が入っていることを想定していますので、野生型プローブのみで反応する細胞が多数存在する中に、野生型と変異形のプローブで反応する少数の細胞が検出できれば（変異のある個々の細胞レベルでは素直にヘテロ、１：１で発現していると考えます）ので、特異性の検証は比較的容易かと思うのですが、実際には条件設定が大変かもしれませんね。

現在も、promoter regionの変異を実験計画の解析の対象に含めるか悩み中です。変異を検出できたとしても、細胞に野生型と変異形のゲノムDNAが１コピーずつしかないわけですから、in situ PCRの増幅も「あり」「なし」を判定するするのにはリスクが大きすぎ、まず意味が無いことになります（変異形が検出されればよしとすることは理論上はあり得ますが、怖くて論文にできないでしょう（笑））。現時点ではゲノムのプロモーター領域は解析をしない方向で考えています。

>
> さて、in situ PCRとなると、個人的にはあまり解像度は、あまり信用していません。
>
> 一塩基置換はどのような遺伝子でしょうか？
> 細胞の増殖に関与する遺伝子でしょうか？形態に関与するものでしょうか？
> 仮に細胞の増殖に関与するなら例えば、Ki-67で免染し、あなたの注目している細胞の中で、陽性細胞と陰性細胞をそれぞれマイクロダイセクションし、それぞれシークエンスするとか。

遺伝子は、サイトカインネットワーク、あるいはその細胞内の情報伝達系を広く考えています。増殖に関与する遺伝子であれば、その腫瘍組織をレーザーダイセクションで切り取ればいいのですが、おそらく増殖には影響しない変異であり、変異細胞が集団を形成しないとして仮説を立てています。

アドバイスありがとうございました。

>
> もっと、スマートなアイデアがあれば良いのですが。。。
> 私も知りたいところです。

もしいいアイディアがあれば、ぜひ教えてください。

(無題)

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No.421-3 - 2012/08/06 (月) 08:31:30 - Harmonia

質問。
１．「既知の１塩基置換の遺伝子変異を有する細胞」と「変異を有しない野生
型の細胞」が混在している組織って、何を想定していますか？

「野生型と変異型のヘテロ」接合体の個体であれば、どこの細胞でも野生型の
遺伝子と変異の遺伝子の両方をもっているはずですが。

２．なぜ「変異が既知」ですか？

(無題)

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No.421-2 - 2012/08/04 (土) 20:04:10 - KEN

DNAプローブ、RNAプローブだとまず無理だと思います。
残るは、LNA, PNA等々を用いシビアな条件でハイブリ。。。
かとは思いますが、in situですとPNAプローブでも難しいかとおもいます。(PNAプローブは商業ベースの商品でない特注品は、非常にお金もかかりますし。)

以下、あくまで私の妄想の世界と思ってお付き合い下さい。

仮に上記問題が解決したとしても、Mutant型のプローブだけでハイブリさせると、おそらく非特異反応なのかさっぱり分からなくなる気がします。
よって、競合的にMutant型とWild型の2種類のプローブの混合液を作り、同時にハイブリさせる必要があるかなと。

思いつく方法としては、Mutant型 probeとwild typeプローブをPNAあたりで作成し、それぞれ別のラベルをし、シビアな条件でハイブリ、発色させれば、発現量によって色が変わるかな。というアイデアがありますが、まあ、うまく行けば儲けもの失敗する気がぷんぷんします。

さて、in situ PCRとなると、個人的にはあまり解像度は、あまり信用していません。

一塩基置換はどのような遺伝子でしょうか？
細胞の増殖に関与する遺伝子でしょうか？形態に関与するものでしょうか？
仮に細胞の増殖に関与するなら例えば、Ki-67で免染し、あなたの注目している細胞の中で、陽性細胞と陰性細胞をそれぞれマイクロダイセクションし、それぞれシークエンスするとか。

もっと、スマートなアイデアがあれば良いのですが。。。
私も知りたいところです。

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No.421-1 - 2012/04/17 (火) 16:52:15 - 日出

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