Bio Technical フォーラム

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フローサイトメトリー解析のための細胞分離がうまくいかない トピック削除
No.4205-TOPIC - 2015/06/22 (月) 14:43:03 - haruki
　培養組織（マウス顎下腺）をsingle cellに分離しFACS解析しようとしていますが、組織細胞を十分に分離できず細胞数が不足し解析できないという状態にあります。
　顎下腺はE13マウスから取り出します。増殖因子の細胞の増殖･分化の影響を調べるために間葉組織はdispaseで処理しピンセットで除去しています。適当な基礎培地といくつかの増殖因子を加えた培地で組織をMatrigelに包埋した状態で3日間培養します。
　CntrolにはE13マウスの顎下腺を使っています。E13マウス顎下腺は組織をHBSS (-)に入れパスツールピペットでピペッティングすると、ほとんどの組織をsingle cellにできました。
　培養組織はcollagenase, hyaluronidase, CaCl₂を混ぜ合わせた溶液で酵素処理し、HBSS (-)でよく洗います。その後HBSS (-)溶液中でピペッティングをしているのですがほとんどsingle cellにできません。
　上皮組織細胞で発現している接着分子は理論上これらの試薬で全て切れると思うのですが、現実はそううまくいかないようで足踏み状態です。トリプシンに関しては解析に影響ができるため最終手段として考えてはいますが、まだ手を出していません。組織培養や細胞解析など経験をお持ちの方でアドバイスを頂けると幸いです。
　
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(無題) 削除/引用
No.4205-2 - 2015/06/22 (月) 15:11:03 - ca
理論上、Caが入っている状態ではトリプシンでもカドヘリンは切断できないはずです。
コラゲナーゼ活性にはCaが必要なので、コラゲナーゼ処理の前後どちらかにEDTA処理をしてはどうでしょうか。

フローサイトメトリー解析のための細胞分離がうまくいかない 削除/引用
No.4205-1 - 2015/06/22 (月) 14:43:03 - haruki
　培養組織（マウス顎下腺）をsingle cellに分離しFACS解析しようとしていますが、組織細胞を十分に分離できず細胞数が不足し解析できないという状態にあります。
　顎下腺はE13マウスから取り出します。増殖因子の細胞の増殖･分化の影響を調べるために間葉組織はdispaseで処理しピンセットで除去しています。適当な基礎培地といくつかの増殖因子を加えた培地で組織をMatrigelに包埋した状態で3日間培養します。
　CntrolにはE13マウスの顎下腺を使っています。E13マウス顎下腺は組織をHBSS (-)に入れパスツールピペットでピペッティングすると、ほとんどの組織をsingle cellにできました。
　培養組織はcollagenase, hyaluronidase, CaCl₂を混ぜ合わせた溶液で酵素処理し、HBSS (-)でよく洗います。その後HBSS (-)溶液中でピペッティングをしているのですがほとんどsingle cellにできません。
　上皮組織細胞で発現している接着分子は理論上これらの試薬で全て切れると思うのですが、現実はそううまくいかないようで足踏み状態です。トリプシンに関しては解析に影響ができるため最終手段として考えてはいますが、まだ手を出していません。組織培養や細胞解析など経験をお持ちの方でアドバイスを頂けると幸いです。
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