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(無題) 削除/引用 No.4184-21 - 2015/06/17 (水) 10:43:26 - Chip みなさま わたくしの質問に対するたくさんのアドバイス、ご意見ありがとうございました。 最近の論文で、Chipアッセイをよく見かけるようになっていますが、十分にアッセイの利点・欠点を考慮したうえで実験を行いたいと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4184-20 - 2015/06/17 (水) 04:50:47 - 遺伝子X >[Re:19] おおさんは書きました : >ちょっととげとげしく感じられたらお詫び申し上げます。 いや、さっぱりそんなことは思っておりませんです。おおさんのおっしゃる >わざと反対の立場に立ってchipの意義があぶり出せたらと思った次第です。 というのは、十分に意味があることと思います。 ただまあ、やはり私の意見としては、Chip assayはまだそこまで気楽にできる実験ではない、むしろ、レポーターassayなりなんなりで、ポジティブな結果が出るはずとある程度信じられるだけのベースになるデータがあって初めて手をつける実験かと思っています。もちろん、 >なにがなんでもポジに見えそうなコンディションを見つけようと躍起に というのはまずいと思いますが。 > わたしもそこはそうかと思います。結論づけられないとはおもいますが、仮説をたてるのはありなのかなとおもいます。まあ、仮説の確実性を上がるためにリポーター使うにしてもそうでないにしても多角的に実験して寄せる方が確実だと思いますし、 とはいえ、トピ主のChipさんの最初の質問の仕方なり、質問への返答の内容なり(特に最初のTK-1さんとChipさんのやりとり)を見ますと、Chip assayについて検討するよりも、まずは王道的に転写活性の実験を始めること、始める方が良い理由を考えること、がChipさんにとって大事だろうと思いました。 > 概して遺伝子Xさんの実験の筋道には同意していますし、わたしのそう言う風に書こうとしていたわけです わかります。おおさんや私のみならず、ppさんやTK-1さん、TSさんも同じ筋道で考えていると思います。ある程度の知識と経験と予備実験の結果なりがあるならば、同時進行もありかと思います(siRNAの話ではいかにも弱いので、私が上司ならGoサインは出せませんが)。

(無題) 削除/引用 No.4184-19 - 2015/06/17 (水) 02:31:10 - おお >[Re:18] 遺伝子Xさんは書きました : > >リポーターをつかっても直接かは究極的にはわからないわけだし > というのは、Chip assayでもそうじゃないかなあ、と個人的には思います。 どの実験もそうですが、過信するべきではないということかと思いますし、それについてはおっしゃる通りかとおもいます。 > >リポーターつくっていろいろやって結論が出ないより、Chipやってつかないからあきらめる > は自分の経験から言うと考えづらいなあ、と思います。 リポーターは確実性はたかいかとおもいます。ただプロモーターと上流けっこう上の方までとってきて、リポーターつくったけどなんだか活性が弱すぎて全然説得力がなかったりしたケースを見たことがあります。あとは論文をそれなりに読んできたひととか、そう言う実験をしてきた人がいない場合は、変なところに入り込むのもあることで、質問者はあまりそこら辺は明るくないような気がするなと思った次第です。もちろん転写という分野の実験をしようとしているわけですから、本当のことをいうと論文、プロとコールをよんで取り組んでいって欲しいところでもありますけど。 >リポーターassayとChip assayを比べたら、条件検討にかかる労力が後者の方がはるかに大きい。 確かにトリッキーな実験かと思います。ただあまり知られなかった時よりははるかに情報が増えているのはたしかです。Chipで使われている抗体とその条件が手に入るならポジコンをおいて判断できる系とするという考え方もあるのかなと思えています。ただそれでも難しい実験であることは否めませんけど。 > >でも最近は実際に染色体上でそこに結合しているはずだから見ろって要求されると思うし。 > > そうなんですか? 要するにChip assayをしろと要求されるということでしょうか? 私はここ数年うさんくさいChip assayのデータが増えたなあ、と思っていたのですが chipがはやりだしてからここでもchipのデーターを要求されたとか、最後はchipまでやれば説得力があるという議論が出だしたのをおぼろげながらおぼえています。リポーターをつかって絞り込んだ段階で、ある意味思い入れができてしまうので、なにがなんでもポジに見えそうなコンディションを見つけようと躍起になる傾向はあると思います。 >[Re:17] 遺伝子Xさんは書きました : >転写因子のような下流のターゲットが数多くあるものをsiRNAで抑えて、それで遺伝子Aの発現が下がったからそのプロモーターにくっつくに違いないというのはちょっと飛躍が過ぎるなあ、 わたしもそこはそうかと思います。結論づけられないとはおもいますが、仮説をたてるのはありなのかなとおもいます。まあ、仮説の確実性を上がるためにリポーター使うにしてもそうでないにしても多角的に実験して寄せる方が確実だと思いますし、publishしやすいと思いますので、そこは質問者さん自身で工夫をして欲しいところですね。蛋白合成をとめて、その転写因子の蛋白をトランスフェクションして、mRNAの上昇をみるってどうかな?っと難易度の高い実験をいまおもいつきました。 概して遺伝子Xさんの実験の筋道には同意していますし、わたしのそう言う風に書こうとしていたわけですので、わざと反対の立場に立ってchipの意義があぶり出せたらと思った次第です。ちょっととげとげしく感じられたらお詫び申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.4184-18 - 2015/06/17 (水) 00:12:26 - 遺伝子X >[Re:15] おおさんは書きました : > >[Re:11] 遺伝子Xさんは書きました : > > > というパスウェイが存在する可能性があると思うのですが、この可能性を却下できるだけのデータがあるのでしょうか？ > > これって具体的にどうします? 先にChipさんに返答した通りで、悪魔の証明なので方法は無いと思います。おおさんはわかって書いておられると思いますが。 なので、転写因子が遺伝子Aのプロモーター領域にくっつくというデータをダイレクトに出すしか無いと思います。だから、いきなりChip assayもありなんじゃないか? とおおさんはおっしゃているのかと思います。しかし、 >リポーターをつかっても直接かは究極的にはわからないわけだし というのは、Chip assayでもそうじゃないかなあ、と個人的には思います。まあ、電子顕微鏡で直接見る、とか以外の実験は全てそうだろう、というオチになるんですが。 あと、 >リポーターつくっていろいろやって結論が出ないより、Chipやってつかないからあきらめるっていう方がなんか速いようなきもするし。 は自分の経験から言うと考えづらいなあ、と思います。リポーターassayとChip assayを比べたら、条件検討にかかる労力が後者の方がはるかに大きい。Chip assayは直ぐに出ない、でもそれはIPの条件が悪いからではないかと疑って、いろいろとやって初めてバンドが出る、でも、もしかしたらfalse positiveかと思って、また色々と調べる。かなり時間がかかって、やっと確信が持てる、という経験ばかりしてきましたが、周りのきちんと実験している人も似たようなものでした。広い世の中にはChip assay名人もいるのかもしれませんが。。。 >でも最近は実際に染色体上でそこに結合しているはずだから見ろって要求されると思うし。 そうなんですか? 要するにChip assayをしろと要求されるということでしょうか? 私はここ数年うさんくさいChip assayのデータが増えたなあ、と思っていたのですが(わかりやすいのだと、適用がWBのみの、IPにも使えないような抗体で出していたりとか)、これが理由だったのかなあ。

(無題) 削除/引用 No.4184-17 - 2015/06/16 (火) 23:24:43 - 遺伝子X > ＞転写因子は遺伝子Aではなく遺伝子Xを制御 -> Xがなんらかのメカニズムで遺伝子Aの発現を制御　というパスウェイが存在する可能性があると思うのですが、この可能性を却下できるだけのデータがあるのでしょうか？ > > これは難しいご質問ですね。証明する方法があるでしょうかね？ > 証明する方法、は無いと思います。つまりは悪魔の証明だし。私の質問の仕方が悪かったのですが、私の質問はTK-1さんの >遺伝子Aの発現はその転写因子に依存するんですか？ という質問と、それに対するChipさんの返答 >この転写因子をsiRNAで発現抑制すると、遺伝子A, B, Cの中の遺伝子Aの発現のみ抑制されました。siRNAの配列から遺伝子Aへの干渉はないと考えられ、この転写因子が遺伝子Aの発現に重要ということが判りました。 にかぶせたものです。転写因子のような下流のターゲットが数多くあるものをsiRNAで抑えて、それで遺伝子Aの発現が下がったからそのプロモーターにくっつくに違いないというのはちょっと飛躍が過ぎるなあ、と思ったのです。それで、転写因子を抑えて遺伝子Aが抑制されるメカニズムは他にも考えられるよ、というのを言うために質問させていただきました。

(無題) 削除/引用 No.4184-16 - 2015/06/16 (火) 23:06:17 - TK-1 いい抗体があるという前提ですが、本気でやるならとっととChIP-seqでもやってください。

(無題) 削除/引用 No.4184-15 - 2015/06/16 (火) 16:09:40 - おお >[Re:11] 遺伝子Xさんは書きました : > というパスウェイが存在する可能性があると思うのですが、この可能性を却下できるだけのデータがあるのでしょうか？ これって具体的にどうします? レポーターつくって、過剰発現やKDしても結局直接かどうかわからないわけだし。 コンセンサス配列があって、それをつぶしたら反応がなくなったといっても、直接ついているかどうかわからないわけだし。一応ゲルシフトとかオリゴのDNAとその蛋白でくっつくかどうか調べたとしても、それは試験管ないでくっついたっていう話ですし。それぞれクリアーしていくと確かに可能性は高くなってきてpublishはしやすくはなるでしょうけど、でも最近は実際に染色体上でそこに結合しているはずだから見ろって要求されると思うし。 まあ結論が出にくいかもしれないですが、誘導性の発現ベクターをつかって、その蛋白の発現してきた早い時期でリポーターが反応するかなどは可能性のある実験ですけど。

(無題) 削除/引用 No.4184-14 - 2015/06/16 (火) 15:54:31 - おお >[Re:13] ppさんは書きました : > 色々意見が出ているようですが、 > やはりプロモーターアッセイが先だと思います。 > CHIPで結合していても、「制御しているかもしれない」という > 結論しか得られません。 > それともすでに報告があるのでしょうか。 > > 遺伝子Xさんの意見はもっともだと思います。 > プロモーターアッセイをやっていて重要な配列がわかっていれば > そこに転写因子のコンセンサス配列があるかどうかも調べられますし、 > 転写因子が本当にそのコンセンサス配列を使って直接Ａの制御をしているなら > 変異を入れて転写活性が下がれば直接Aに制御されているということを > 言うこともできると思います。 > > プロモーターアッセイ用のベクターがある、あるいは買える環境であれば > あとあと論文にすることを考えたら必要だと思います。 > reviewerにまず要求される実験だと思いますので。 それは確かにそう思ったので書こうか悩んだんだけど、いきなりChipっていうアプローチがあってもいいかなぁとも思い始めている。KDしているのでエンドの遺伝子でプロモーターアッセイしているようなもんだし。リポーターをつかっても直接かは究極的にはわからないわけだし、だからChipが出てきたっていう話でもあるし。 Chipでくっついていたなら、その領域をつかってリポーターをつくってという手順でもまあいいかなぁって。 リポーターつくっていろいろやって結論が出ないより、Chipやってつかないからあきらめるっていう方がなんか速いようなきもするし。 たしかにChipで100%検出可能なわけではないので、Chipでポジにならなくてもリポーターである程度のことはいえるところまで持っていけることはまあまああるとはおもいますけど。

(無題) 削除/引用 No.4184-13 - 2015/06/16 (火) 15:37:18 - pp 色々意見が出ているようですが、 やはりプロモーターアッセイが先だと思います。 CHIPで結合していても、「制御しているかもしれない」という 結論しか得られません。 それともすでに報告があるのでしょうか。 遺伝子Xさんの意見はもっともだと思います。 プロモーターアッセイをやっていて重要な配列がわかっていれば そこに転写因子のコンセンサス配列があるかどうかも調べられますし、 転写因子が本当にそのコンセンサス配列を使って直接Ａの制御をしているなら 変異を入れて転写活性が下がれば直接Aに制御されているということを 言うこともできると思います。 プロモーターアッセイ用のベクターがある、あるいは買える環境であれば あとあと論文にすることを考えたら必要だと思います。 reviewerにまず要求される実験だと思いますので。

(無題) 削除/引用 No.4184-12 - 2015/06/16 (火) 13:06:46 - Chip 遺伝子Xさん ＞転写因子は遺伝子Aではなく遺伝子Xを制御 -> Xがなんらかのメカニズムで遺伝子Aの発現を制御　というパスウェイが存在する可能性があると思うのですが、この可能性を却下できるだけのデータがあるのでしょうか？ これは難しいご質問ですね。証明する方法があるでしょうかね？ 蛇足になるかもしれませんが、転写因子の遺伝子発現調節はかなり複雑と理解しています。複数の転写因子が協調して発現を調節している遺伝子も存在します。また、ノンコーディングRNAによる遺伝子発現調節も然りでしょう。 遺伝子Xさんのご質問にある遺伝子XがあるノンコーディングRNAをコードしているかもしれませんし、非常に複雑になりますね。

(無題) 削除/引用 No.4184-11 - 2015/06/16 (火) 12:43:14 - 遺伝子X > この転写因子をsiRNAで発現抑制すると、遺伝子A, B, Cの中の遺伝子Aの発現のみ抑制されました。siRNAの配列から遺伝子Aへの干渉はないと考えられ、この転写因子が遺伝子Aの発現に重要ということが判りました。 転写因子は遺伝子Aではなく遺伝子Xを制御 -> Xがなんらかのメカニズムで遺伝子Aの発現を制御　 というパスウェイが存在する可能性があると思うのですが、この可能性を却下できるだけのデータがあるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4184-10 - 2015/06/16 (火) 12:07:50 - Chip TK-1様 ＞遺伝子Aの発現はその転写因子に依存するんですか？コンセンサスがあればすべてがその因子に結合している訳ではないですよ。 この転写因子をsiRNAで発現抑制すると、遺伝子A, B, Cの中の遺伝子Aの発現のみ抑制されました。siRNAの配列から遺伝子Aへの干渉はないと考えられ、この転写因子が遺伝子Aの発現に重要ということが判りました。 現在、この遺伝子Aのプロモーター領域をDBTSSで確認して、おお様のアドバイスを参考にこの転写因子が結合しそうなコンセンサス配列を探っています。 コンセンサス配列があるのに、転写因子が結合する場合としない場合があるのは興味深いですね。制御機構があるのでしょうか？刺激の種類によってメチル化ー脱メチル化が起こるDNAが選択されるなどは予想できますが。 おお様 この転写因子のsiRNAにおいて、遺伝子Aの発現が低下したことから、遺伝子Aの発現にこの転写因子が確かに重要だという証拠をみたくてChip assayを試みようと考えました。

(無題) 削除/引用 No.4184-9 - 2015/06/16 (火) 07:56:38 - TS DBTSSで転写開始点は予測されているものが多いと思いますが、 過去の研究でプロモーター解析がされていない遺伝子なのですか。 そうなら先にプロモーター予測配列をクローニングしてみて、プロモーター解析から始めたらどうかと思いました。なんならちょっとした論文一本になりえると思います。

(無題) 削除/引用 No.4184-8 - 2015/06/16 (火) 07:27:44 - おお そうなんですよね。。。どうして転写活性の実験よりも先にくっつくかどうかの実験になるんだろうとわたしも思ったりしたんですけど、今は逆のアプローチする人もいるのかなぁっとも。。。どうなんでしょうねぇ。

(無題) 削除/引用 No.4184-7 - 2015/06/16 (火) 07:08:06 - TK-1 遺伝子Aの発現はその転写因子に依存するんですか？コンセンサスがあればすべてがその因子に結合している訳ではないですよ。ChIPに利用可能な抗体があるということはその因子がつくターゲットはわかっているということですよね。それをポジコンに使えればいいですが。

(無題) 削除/引用 No.4184-6 - 2015/06/16 (火) 00:35:04 - おお >配列を抽出してきてblastしてもいいかと思います。 正確にはmultiple alignmentでした。

(無題) 削除/引用 No.4184-5 - 2015/06/15 (月) 16:03:04 - おお DBTSSは転写開始位置がわかるデーターベースだと思いましたが、私が勘違いしてたら教えてください。転写開位置をふくむRNA polymeraseなどが結合するのに必要な領域をプロモーターといいますが、これだけだとあまりうまく機能しません。 組織特異的な発現はなどはそのプロモーター上流にあるエンハンサーによって制御されていることがたいていです。 エンハンサーはたいていの場合転写因子のコンセンサス配列をもっていて、その転写因子が結合することによって下流などのプロモーターを活性化します。 なのでプロモーター領域(転写開始点)から上流を見て、コンセンサス配列があれば、そこに結合してプロモーターの活性を制御している可能性があるということです。そのコンセンサス配列に結合するという仮説のうえでChipをするわけでしょうから、その前後の配列でChipでえられたDNAをPCRするのが、straightforwardな実験だと思いますけどどうでしょうか? ちなみにエンハンサーはプロモーターの上流1-2kbpに見つかることも多いですが、10kbp上流に合ったり、また下流にあったりもします。なのでどこまで見るか判断が難しいところです(哺乳類のゲノムに関してですが)。 まあコンセンサス配列をむしして、300bpぐらいでずらしていって、上流2-3kpb全部スキャンしてしまってもいいかもしれません。まあそれでも精度てきには1kbp位の幅があるとはいわれています。 あとはいろいろな動物で、その遺伝子のプロモーター前後の配列を抽出してきてblastしてもいいかと思います。必ずしもとはいえませんが、制御に必要な配列は保存されていたりすることもよくあるようです。

(無題) 削除/引用 No.4184-4 - 2015/06/15 (月) 14:42:27 - おお >プロモーター領域がこの遺伝子に特異性が高いかどうかは、ＢＬＡＳＴで確認しようと思っています。 ?

(無題) 削除/引用 No.4184-3 - 2015/06/15 (月) 14:14:17 - Chip おお様 ありがとうございます。転写因子が結合するコンセンサス配列は重要ですね。プライマー作成時に、コンセンサス配列とプロモーター領域を含んだプライマーが理想という事でしょうか？あるいは、コンセンサス配列から転写因子の結合部位を推測し、その下流にプロモーター領域があれば、ここをChip assayのＰＣＲ標的とするのが効率が良いという考えでよいでしょうか？ プロモーター領域がこの遺伝子に特異性が高いかどうかは、ＢＬＡＳＴで確認しようと思っています。

(無題) 削除/引用 No.4184-2 - 2015/06/15 (月) 13:03:39 - おお その蛋白が認識するDNAのコンセンサス配列がいるんじゃないか?

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