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(無題) 削除/引用 No.4176-16 - 2015/06/12 (金) 18:38:12 - AA 脳では灌流さえしっかりして血が抜けていれば マウス抗体でも全く問題なくワークしますね

(無題) 削除/引用 No.4176-15 - 2015/06/12 (金) 15:12:37 - おお マウスの抗体でマウスの組織をそれほど複雑なことをしないで染めてるのはみたことはあるような気がします。抗体や組織、発現量次第なのではとおもいます。コントロールをとればはっきりするはずです。

(無題) 削除/引用 No.4176-14 - 2015/06/12 (金) 15:03:11 - 組織 まずは抗体がパラフィン組織で適用可能かどうかを確認した方が良いと思います。 ラボで凍結切片を持っているなら、染めてみたらどうでしょう。 マウス組織であっても、mouse on mouseのキットを使わなくても、抗体がワークしてればシグナルはちゃんとみえますよ。もちろん二次抗体由来のバックは出ますが、すでに指摘があるように、適切なコントロールを横において比較すれば、シグナルとバックの判別は可能なはずです。

(無題) 削除/引用 No.4176-13 - 2015/06/12 (金) 11:31:48 - ECOS みなさんアドバイスありがとうございます。 同僚が違う組織でマウスのモノクロで綺麗に染めていたのでまさか抗体が原因だなんて思ってもいませんでした...orz 灌流と洗浄をしっかり行ってラットの組織(実はまだ肝臓しか試していなかったので)でいろいろ試してみてそれでもだめなら一次抗体をラベリングしようと思います。

(無題) 削除/引用 No.4176-11 - 2015/06/12 (金) 00:06:15 - くぁswでrftgyふじこ 名前違うけど６です。 マウス組織で、2次抗体がanti-mouse IgG antibodyなんだからもし血が残ってたらそりゃバックは出るわ。ラットもIgG は似てるから反応するものもあるからバック出るかもね。組織摘出時にPBSなどで還流と洗浄を入念にやって出来る限り血液除けばある程度はなんとか出来るかもしれないけど、高感度だから完全には難しいね。

(無題) 削除/引用 No.4176-10 - 2015/06/11 (木) 15:43:45 - AP 適切なコントロールを取らないとトラブルシュートを当てずっぽうでするしかないじゃんか。 例えばこんなコントロールはとっているだろうか？ 1) 一次抗体のみスキップ→いま全体的に染まっているというのが本当に一次抗体の反応を見ているのか？　二次抗体の非特異的吸着を見ているのではないか？　逆に、これで全く染まっていないのであれば、抗マウスIg二次抗体が内在性のIgやFcレセプターなどと反応する影響は無視できるということ。 2) 二次抗体をスキップ→自家蛍光がどの程度、どのように出るかを確認。ひょっとすると、今見えているのは自家蛍光のノイズだけで、目的のシグナルは埋れているのかも。そうであれば、自家蛍光を軽減する処理や、標識の波長域、フィルターの波長域を工夫するなどを考える。

(無題) 削除/引用 No.4176-9 - 2015/06/11 (木) 11:33:12 - hana マウスモノクロ……。 手持ちの本に、 マウス一次抗体を用いてラット組織の免疫染色を行う場合は、抗マウス免疫グロブリン二次抗体と内因性ラット免疫グロブリンとの交差反応が生じる。 とあるので、そうなんでしょう。 賦活化条件ではなく、抗体の変更か、M.O.M kit をお勧めします。

Oh my god. 削除/引用 No.4176-8 - 2015/06/11 (木) 10:41:59 - DrCarter マウスのモノクロなら蛍光二次抗体は抗マウス抗体をしていますよね。 ということは当然。。。わかりますよね？ マウスの組織にそのままマウスの一次抗体を使用することは通常できません。 対応策としては以下のようなものが挙げられます。 １：予め蛍光抗体が結合されたcongugatedの抗体が市販されていれば、それを使う。 ２：Mouse on mouseのキット（http://www.funakoshi.co.jp/contents/5412）を使う。 ３：ラベリングキットを用いて先に一次抗体と二次抗体を結合してから使う。（https://www.lifetechnologies.com/jp/ja/home/brands/molecular-probes/key-molecular-probes-products/zenon-labeling-technology.html） ラットもダメな理由はわかりませんね。条件の問題なのか発現の問題なのかわからないので、ポジコンとネガコンがあればいいのですが、組織の場合難しいですかね。必ず発現している組織と、絶対発現していない組織が既知であれば、それらを使用するのがよいと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.4176-7 - 2015/06/11 (木) 08:34:54 - ECOS マウスのモノクロですが抗体のDSによればエピトープはヒトやラットでも確認されているので大丈夫かなと ヒトの組織由来のcell lineでは反応してました。

(無題) 削除/引用 No.4176-6 - 2015/06/11 (木) 01:41:22 - くぁwせdrftぎゅいおp 抗体の動物種はなによ。もしかマウスモノクロとか？

(無題) 削除/引用 No.4176-5 - 2015/06/10 (水) 16:56:57 - hana 私のところはパラフィンで蛍光もやりますが、大まかな条件の決定はAECかDABでやっています。 その方が観察が楽なので。 賦活化は100℃〜120℃までの間で、クエン酸系pH6〜pH9とEDTA、オートクレーブ15分〜ボイル40分あたり。 総当たりでやるとかなりな数になるのですが、メーカー推奨からいくつかやればだいたい当たります。 そのあと蛍光で、希釈をふればきれいなものもあるかと。 とりあえず、その抗体がパラフィンできれいに染まるかどうか確認をして下さい。

(無題) 削除/引用 No.4176-4 - 2015/06/10 (水) 15:51:15 - 独り言 4%PFAと10%ホルマリンは同じようなものなので、どちらでもいいと思う。

(無題) 削除/引用 No.4176-3 - 2015/06/10 (水) 15:20:16 - ECOS 独り言さんアドバイスありがとうございます 凍結切片も考慮しているのですが、うちのラボの実験機器の都合上できればパラフィン切片で観察したいのです... PFA固定の凍結切片とありますが現在組織の固定は10％ホルマリンを用いています。PFAによる固定とホルマリンによる固定では固定に掛かる時間が違うようですが抗原の状態等に違いが出てくるということでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4176-2 - 2015/06/10 (水) 10:22:06 - 独り言 パラフィン染色はそもそも自家蛍光が強いので、蛍光染色は一般的にされない。だからDABでやるのが普通だし、細胞内局在を見るのには向いていない。細胞内局在を蛍光で見る必要があるなら、凍結切片だベター。 また培養細胞で染色ができる抗体でもパラフィンだと抗原の変性状態が違うので、パラフィン染色に使えるとは限りません。抗体認識的には、培養細胞、PFA固定の凍結切片、パラフィン切片の順に下がっていくと思う。

組織を用いた蛍光免疫染色 削除/引用 No.4176-1 - 2015/06/10 (水) 08:27:12 - ECOS ただいまマウス及びラットの組織をパラフィン包埋し、抗体を用いて蛍光染色を行っております。 見ている組織は様々で一次抗体にミトコンドリアのCOX IV抗体を用いてミトコンドリアを染めたいと思っていますがうまくいかず、よく見られる顆粒状の様体が見られません。どちらかというとバックグラウンドのように全体的に染まってしまいます。DAPIによる核染色は綺麗に検出できます。 現在抗原の賦活化はクエン酸バッファー(pH6.0)、100℃で10分間処理しています。今後抗原の賦活化の検討を行っていくつもりですが何かアドバイスなどあればご教授ください。 培養細胞での蛍光免疫染色はうまく染まっているので抗体に問題はないかとは思うのですが... 当方いろいろ調べたのですが組織のミトコンドリアを蛍光免疫染色によって染めている論文等も見当たらずほとんどがDAB染色でした。唯一見つけたのは凍結切片によるものでパラフィン切片では難しいのでしょうか？

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