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(無題) 削除/引用 No.4174-9 - 2015/06/14 (日) 14:57:13 - エンタツ こんなにアドバイスをくださりありがとうございます。 少量ずつセットの抗体を購入すれば、現時点でもお金をそんなにかけずに行えそうですね。 今後、共同研究の先生にこんな感じの話をするので、抗体を分けてもらうなりしたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.4174-8 - 2015/06/10 (水) 16:39:34 - み >[Re:5] エンタツさんは書きました : > お二人の言う通り細胞内の内在性タンパク質の影響を見るにあたって、抗体を購入する必要があるのは理解できます。 目的が限られた蛋白種に対する影響を見るということでしょうか？ 想像するにおそらく生体適応性材料とやらが生体に及ぼす影響をみる必要があるのでしょう。 それならば例え１０００種類の蛋白発現変化をwesternで検討したところで生体に適応する材料かどうかの優劣をつけることはできないと想像する。 westernは蛋白抽出物中に含まれる標的蛋白のある程度の量を見ているに過ぎないし、変化しなかったからと言っても活性に影響を及ぼしているかは不明。 １０００種類に変化がなくてもその他の重要な蛋白に甚大な影響が出ている可能性もあるし。。。 さらにmRNA発現アレイやったからと言っても何も見えてこない気がするしなあ。

(無題) 削除/引用 No.4174-7 - 2015/06/10 (水) 16:25:12 - おお いいかどうかは、、、あなたの研究と研究費次第じゃないでしょうか、、、あったに越したことはないですが、なんにもないところからいっぺんにというとけっこうキツいですけど、研究を続ける上で必要なものを買っていけばけっこういろいろ種類が長い目ではたまるもんです。あと同じシグナルカスケードにある抗体を何種類かバラよりも少量だけどセット価格でいくらやすくでかえるものとか、ありますし、初回だけサンプルサイズで少量をやすくで売ってくれるところもあったような気がしますし。 http://dshb.biology.uiowa.edu/ ここだとhybridomaが分泌した抗体をふくむ培地をやすくで分けてくれるし、hybridomaじたいも売ってくれるので一度買えばちゃんとメンテすれば永遠に使えます(けっこう飼うの大変みたいだけどね、あとコストもいくらかはかかる)。 共同研究などで抗体をシェアすることもあるでしょう。 もちろんWB以外の方法論で攻めれるならそれはそれでいいじゃないですか。

(無題) 削除/引用 No.4174-6 - 2015/06/10 (水) 16:16:23 - f どこでも抗体を買うか作るかしてるのが普通だと思います。 むしろ、タグ付タンパク質を発現させるほうが実験の目的が制限されるように感じます。 確かに抗体は高いですが、小容量のものを買うとか、サンプラーキットを買うとかして多少は安くはなります。 どうしても安く済ませたければ、RT-PCRでmRNAの発現を見た方が安上がりですけど、mRNAの発現とタンパク質の発現、もっと言えばタンパク質の活性は必ずしも一致しないことは考慮しないといけない場合もあります。 いずれにしても研究はお金がかかるものです。

(無題) 削除/引用 No.4174-5 - 2015/06/10 (水) 15:42:58 - エンタツ お二人の言う通り細胞内の内在性タンパク質の影響を見るにあたって、抗体を購入する必要があるのは理解できます。 しかし、抗体を購入するとなると1つあたり数万するのであまり頻繁には買えません。 それでも、ある程度の抗体を取り揃えておいたほうが良いのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4174-4 - 2015/06/10 (水) 15:40:30 - R western blotに熟練していない所が、タグ付きで過剰発現させて、 タグ認識抗体でお手軽に行っているイメージです。 条件検討のノウハウが充実していたり自分で抗体作っている、 むしろDNAを扱ったことがほとんど無いような研究室の方が、 westernは強いと思います。 私は基本、内在性を見たいので、specific antibodyを使用して、 うまくいかない時にタグ付きを作製してみるといった感じです。

(無題) 削除/引用 No.4174-3 - 2015/06/10 (水) 10:33:36 - 独り言 > 前いた研究室では DNA を扱って細胞内の代謝経路中のタンパク質の発現を調べるために作製した plasmid を transfection したりしていました。インサート DNA は自分たちで合成していたので、Flag や　Myc などを使って基本なんでも western blot で発現を調べることができました。 それって、酵母とかの内在性のタンパク質にタグをつけて見ていたってことでいいのかな。たしかにそれなら、内在性のタンパク質も簡単にタグのwesternでみれて便利ですよね。でも哺乳類とかゲノムの編集が便利でない生物（最近はCRISPRができてきたが）では内在性のタンパク質にタグをつけるのはかなりの労力が必要となるので、内在性のタンパク質を認識する抗体を使うことが超一般的です。それにタグをつけることでタンパク質の機能を阻害する心配があるし。あといろんな抗体さえがあれば、ライセート１つからたくさんのタンパク質の検出できて便利です。だから有用な抗体をもっているということは研究室にとって武器でもあるのです（特に昔は）。

(無題) 削除/引用 No.4174-2 - 2015/06/09 (火) 23:51:32 - おお プラスミドでいろいろな発現ベクターは作ってますけど、目的のものに対する抗体はかってウエスタンしますけど。tagのついた強制発現した蛋白の影響を調べるなら、そのほかの蛋白をWBすることはありますし。 臨床研究では人体にプラスミドはtransfectionしないので、抗体をかってWBや免疫染色すると思いますし、発現ベクターを使いたいけどtransfectionが難しい生物種を使っているのでできないラボもなら抗体を買うか、売っていない可能性も高いので自分のラボで作ってたりもするでしょうし。 野生生物を対象にするならトランスフェクションされた生物がいるわけないですし、タグで検出なんかできませんし、、、特異的な抗体使うでしょう。 WBはタンパク質を検出する方法でどの様に利用するかは研究者次第ではないでしょうか。 まあわたしが自分以外の研究室でどうしていると書くよりは、それぞれの研究室の人が書き込んだ方がいいでしょうから、それをまって見てもいいでしょうけど。

western blot の活用方法 削除/引用 No.4174-1 - 2015/06/09 (火) 23:19:05 - エンタツ お世話になっています。 私の研究室では生体適合性材料の開発をしています。 そこで、昔別な研究室で行っていた westerb blot を使って in vitro での評価を行おうとしています。 前いた研究室では DNA を扱って細胞内の代謝経路中のタンパク質の発現を調べるために作製した plasmid を transfection したりしていました。インサート DNA は自分たちで合成していたので、Flag や　Myc などを使って基本なんでも western blot で発現を調べることができました。 しかし、今の研究室では DNA 関係は一切やっていないので、あるタンパク質が見たい場合、企業の抗体を購入してそれを使っていくしかありません。 やはり、western blot は DNA を扱っている研究室などが使うべき技術なのでしょうか？ 似たような研究室でどんなことを westerb blot を使っているか軽くでいいので教えていただけませんでしょうか？

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