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(無題) 削除/引用 No.4162-3 - 2015/06/08 (月) 14:52:40 - おお 一回のPCRではうまく増えないから二段階で増やすわけですよね。 1 copyのDNAは理想的には34サイクルぐらいで検出できるレンジにくるそうです。なので1回のPCRでたいていは事が足ります。 なぜ2段階にしないといけないかは、ミスあニールによる副産物などができバンドがきれいに出ないとか、副産物ばかりでバンドがけんしゅつできないとか。後は効率の問題もあるでしょう。 副産物がふえるとまた副産物どうしで変なこともおこったりするので、意図しない邪魔者がどんどんできることになるので、そう言うものをなるべく持ち込まない方がいいのではないかとおもいます。 また目的のものであってもあまり増えすぎるとやはりミスアニーリングも顕著になると思いますので、テンプレートがいっぱいあればというわけでもないと思いますが、これはサイクルで調整できるかもしれません。 たしかにプライまーもあまり持ち込みたくありませんね。100倍、千倍に希釈して2ndにすすむプロとコールも見たことありますし、以下のURLでは 0.5ulを次のPCRにもっていってます。特異性などで希釈倍率はそれぞれナノかもしれません。 http://www.zoology.ubc.ca/~dgmweb/research1_pcr3.htm

(無題) 削除/引用 No.4162-2 - 2015/06/08 (月) 14:44:19 - tora 1stPCRを行った時点で、templateの量はかなり増えているはずであり、希釈しないでnestedPCRを行うとスメアや非特異的増幅が増えるためだと思います。自分も希釈しないでnestedPCRを行い、非特異的増幅がかなり多くなったことがあります。 すでに解決済みでしたらすみません。

Nested PCRno 削除/引用 No.4162-1 - 2015/06/05 (金) 15:20:58 - 高橋 Nested PCRの2nd PCRに持ち込む1st PCR ampliconの量・希釈について目安のようなものはあるのでしょうか。いくつかのプロトコールを見ると、かなり希釈しているようなのですが、これは1st PCRのprimerを持ち込まないためでしょうか。なんとなく、PCRのかかりやすさだけ考えると、templateを多めに入れたほうがかかるのではと思ってしまうのですが。ご助言お願い致します。

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