全20件 ( 1 〜 20 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.4155-20 - 2015/06/05 (金) 01:22:09 - qswでfrvgtbんm 普通に泳動した時に、見たい蛋白質が真ん中くらいに来るようなゲル濃度のゲルで泳動してBPBの青いのが真ん中辺に来たら泳動を途中で止める。 で、青いののところでゲル切って下は捨てる。こうすれば１枚の膜でゲル２つ分をのせて転写できる。転写した後も膜は切らないで、以降は１枚でやる。最初のゲルが違う以外は転写から抗体反応、ECL検出まで全ての工程を同一条件でできる。腕に自身あればゲル３枚分も夢でない気もする、で今度やってみようと思ってる。たぶん来月やる。 ウェスタンで定量（半定量）しようと思うなら、複数ゲルに渡る多検体の場合は、こうでもしないと正直無理だわ。 てか、それよりもまずは直線性のある範囲を予備実験で調べ、おおよそのアプライ量を自分で決めてやらないと、すぐシグナルが飽和して頭打ちになってしまう。リブロットして太いアクチンのシグナルで普通に標準化してる人はたくさんいるけど、。

(無題) 削除/引用 No.4155-19 - 2015/06/04 (木) 23:37:56 - おお ばらつきが生じて解釈が困難なら、計三回ぐらい流して平均したりして傾向が見れないか確認してください。

(無題) 削除/引用 No.4155-18 - 2015/06/04 (木) 22:56:45 - ちえみ それぞれゲルの両端に共通サンプルをアプライし、ＷＢにてシグナルを検出したとき、1枚目の左端と右端の共通サンプルでシグナル強度が異なっていた場合、２枚目の両端の共通サンプルと比較できなくなるということは起こりえますでしょうか。 例えば、メンブレンの抗体のノリが悪かったりなど・・・。

(無題) 削除/引用 No.4155-17 - 2015/06/04 (木) 06:23:17 - ats >[Re:14] ちえみさんは書きました : >メンブレン一枚目に培養日数1日目から5日、二枚目に5日目から10日目培養のサンプルを転写し、 他の方を信用させるには、3日目〜7日目のサンプルを転写した「橋渡し像」もSupplemental dataとして作っておく。共通サンプルを流す手法の拡大版です。データの補正はおおさんのご指摘通り。

(無題) 削除/引用 No.4155-16 - 2015/06/04 (木) 01:51:50 - おお いずれにせよいちど方法論は研究室の皆さんと話してコンセンサスをとってください。publishの段階でこのデーターは不備があるので、協力できないとか、使えないとかややこしいことにならないように。

(無題) 削除/引用 No.4155-15 - 2015/06/04 (木) 00:51:07 - おお No.4155-13にかいた要領でいいです。

(無題) 削除/引用 No.4155-14 - 2015/06/04 (木) 00:31:07 - ちえみ おおさん、何回もしつこく失礼します。 検出はCCDカメラです。メンブレン一枚目に培養日数1日目から5日、二枚目に5日目から10日目培養のサンプルを転写し、かつどちらにも共通のサンプルをアプライ、転写しているとします。CCDカメラの場合は数値化して割り算で補正とのことですが、具体的に割り算でどのように補正が可能になるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4155-13 - 2015/06/03 (水) 23:41:14 - おお 画像自身はいじらない方がいいのでなるべく細かいタイムコースをとるとか、イメージをとっているときに共通のバンドがほぼ一緒にみえるイメージをえる努力をしたほうがいいとおもいます。 計算はもしフィルムなら共通のサンプルで量と直線関係にあるだろうと考えられるバンドの強さのものを選び、2枚目が1枚目の1.5倍なら2枚目のシグナルをすべて1.5で割ればいいでしょう。 CCDカメラで検出するならフィルムの特性は無視できるので、シグナルが強すぎて飽和してなければ、そのまま数値化して割り算で補正すればいいです。 WBのシグナルが量と直線的な関係にあることを担保するのは実際は大変難しいので、上記でも不完全といわれるかもしれませんが、やれる範囲のことをやっていればまずはpublishしても大丈夫だと思います。

(無題) 削除/引用 No.4155-12 - 2015/06/03 (水) 23:26:02 - ちえみ おおさん＞　ありがとうございます。例えばなんですが、１枚目のメンブレンと２枚目のメンブレンの共通サンプルを比較した場合、２枚目の方が１枚目よりもシグナル強度が高かった場合は、１枚目と同等シグナル強度に補正しないといけないと思うのですが、補正するにはどのような操作を行えばよいのでしょうか＞＜？

(無題) 削除/引用 No.4155-11 - 2015/06/03 (水) 23:23:41 - おお >[Re:10] ちえみさんは書きました : > おおさん、両者、共通のサンプルを流す場合、普段ゲルの両端にマーカーをアプライしているのですが、そのそれぞれマーカーの内側のレーン２か所に共通サンプルをアプライという形でも問題ないでしょうか。恐らく１レーンだけ流すよりも複数のほうが良いので・・・ それで比較が可能になりますのでいいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.4155-10 - 2015/06/03 (水) 23:14:57 - ちえみ おおさん、両者、共通のサンプルを流す場合、普段ゲルの両端にマーカーをアプライしているのですが、そのそれぞれマーカーの内側のレーン２か所に共通サンプルをアプライという形でも問題ないでしょうか。恐らく１レーンだけ流すよりも複数のほうが良いので・・・

(無題) 削除/引用 No.4155-9 - 2015/06/03 (水) 22:48:36 - おお 一回り大きいwet のタンクか、セミドライで2つのゲルを一枚のmembraneに移すといくらかはぶれを解消できます。でも両者一応共通のサンプルを流しておいた方がいい。 あるいは電気えいどう御プレステインマーカーを基準にしてその蛋白がある部分を上下余裕をもってきり、一つもmembraneに移すというのも手でしょう。internal controlは近くならそれを含めてもいいし、別のmembraneに移してもいい。

(無題) 削除/引用 No.4155-8 - 2015/06/03 (水) 22:37:36 - おお ドットブロットかELISAにしてしまえばいいとおもった。

同じサンプルを 削除/引用 No.4155-7 - 2015/06/03 (水) 21:25:51 - ちえみ atsさん解答有難うございます。 すみません、私の理解力が悪く…、何故同じサンプルを2つのゲルにアプライして、ウエスタンブロットすることで、シグナル補正をすることができるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4155-6 - 2015/06/03 (水) 17:59:21 - 中年 ウエスタンできちんと定量するのは実は難しいですよ。カメラで取り込んだバンドのシグナル強度でそのまま割り算しているデータを見ますが、そんなデータで「発現量が2.6倍に増えた」なんて言ってる論文を見ると頭が痛くなります。 先程も挙げた大海先生のエッセーが参考になります。 http://www.ims.u-tokyo.ac.jp/ohmiken/Lab%E3%83%A1%E3%83%A2/memo16.html

(無題) 削除/引用 No.4155-5 - 2015/06/03 (水) 17:51:38 - ats >[Re:4] ちえみさんは書きました : > 補正というのは、独り言さんが仰ったポジティブコントロールを用いると言う事なのでしょうか？ 簡単に済ますなら、同じサンプルを流せば良いです（出来れば複数、両脇）。

(無題) 削除/引用 No.4155-4 - 2015/06/03 (水) 17:39:01 - ちえみ 皆様、解説有難うございます。 納得できます。指摘を頂いた方からは、メンブレンを分けるのであれば、ウエスタンブロットの際、シグナル強度を補正すれば良いとのアドバイスを頂いたのですが、その補正というのは、独り言さんが仰ったポジティブコントロールを用いると言う事なのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4155-3 - 2015/06/03 (水) 17:08:11 - 独り言 2枚のゲルに分けると、それぞれ同じ条件で一緒に行ったとしても、転写の効率、抗体のあたり具合、washの効率、発色液のインキュベート時間など微妙な差が色々なところででるため、2枚のバンドの強さを直接比べることは正確性があるとはいえない。 その場合は両方のゲルに基準となるポジコンを加えておき、それぞれのゲルのポジコンに対してのサンプルの増減を相対的に比べるのがよいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.4155-2 - 2015/06/03 (水) 17:07:33 - 中年 トランスファーの効率などがメンブレンごとに揃わない可能性があるからです。それぞれのゲルに校正用のレーンを作れば、それを元にそのメンブレンのバンドは定量できるので、複数のメンブレンのサンプルも比較することは問題ないでしょう。 また、沢山のサンプルを一枚のゲルで泳動するためにコームを自作する手もあります。 http://www.ims.u-tokyo.ac.jp/ohmiken/Lab%E3%83%A1%E3%83%A2/memo%202.html

ウエスタンをするにあたって 削除/引用 No.4155-1 - 2015/06/03 (水) 16:45:49 - ちえみ こんばんは、今、あるタンパク質をSDS-PAGEをして、ウエスタンブロットにて発現状態を調べようとしています。 サンプル数が20サンプルと多く、1枚のゲル、メンブレンでは泳動転写できない状態です。そこで、2つに分けて実験をしなければならないのは確実なのですが、結果として出た発現状態を定量して1つのグラフにまとめたいと思っています。というのは細胞の培養日数に依存してどのくらい発現していっているかを見たいと思っているので。 ただ、ゲル、メンブレンを別々に分けて実験をした時は、データを1つのグラフにまとめられないとの指摘を受けました。 恐らく実験条件が異なる？からだと思うのですが、具体的に何かいけないのでしょうか？

全20件 ( 1 〜 20 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---