全12件 ( 1 〜 12 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

GoTaq® Flexi DNA PolymeraseのTAクローニング 削除/引用 No.4151-12 - 2022/10/12 (水) 11:31:43 - パワハラされたら直に訴えます GoTaq® Flexi DNA PolymeraseでPCR増幅した産物をT vectorにクローニングしようとしています。 通常Takaraのtaqであれば3'側にAが付加されると認識していますが、GoTaq® Flexi DNA Polymerase（promega）でも3'末端にA付加されますでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4151-11 - 2015/06/03 (水) 18:22:51 - tora 皆様アドバイスありがとうございました。 templateはKODの時点で十分に確保できるので、Taqを用いたA付加を行っていこうと思います。大変参考になる意見で助かりました。

(無題) 削除/引用 No.4151-10 - 2015/06/03 (水) 17:09:20 - AP >師匠に聞くと、バンドが非特異なものか、2ndPCRのtemplate濃度が高すぎる為ではないかと言われました。 一旦、PCRをかけて鋳型が多くなっている状態で普通に2nd PCRをかけたら、すぐに鋳型（PCR産物）過剰になります。こうなると、鋳型に対してプライマーが付くより、鋳型鎖同士の不正なアニールからの伸長反応が起こるため、PCR産物の不正な重合体を生じて、高分子側にスメアします。 もし同じプライマーで2nd PCRをかけるなら、1st PCR産物のインプットを極力低く抑えるのがいいですね。一回のPCRでは増やせないような厳しいPCRでは（たとえばcDNA poolから発現量の少ない遺伝子のcDNAを取得するとか）、同じプライマーではまず無理で、nested PCRが必須です。 今回のように末端A付加をするだけなら、PCR（サーマルリサイクル）に掛ける必要はなく、伸長温度で保持しときゃいいのですが。 もし、あえてPCR反応でA付加したいとか、普通のPCR産物に対して制限酵素サイト付きプライマーで再びPCRをかけて末端に制限酵素サイトをつけたいというときは、フラグメントの増幅はあまり必要でないので、PCR産物のインプットを多くして、サイクル数を2-3回とか、ごく少なくすることもあります。

(無題) 削除/引用 No.4151-9 - 2015/06/03 (水) 16:52:08 - AP 最近はじゃ、たいていの製品情報にはインターネットで簡単にアクセス出来るんだから、それくらい自分で調べたらいいと思うのよね。今後のためにも。 http://www.toyobo.co.jp/cgi-bin/blog/applications/files/seihin/pcr/20061001BTQ1.pdf http://www.toyobo.co.jp/seihin/xr/lifescience/products/product/pcr/archives/2006/09/blend_taqblend_taq_plus.html#jisshirei

(無題) 削除/引用 No.4151-8 - 2015/06/03 (水) 11:34:31 - tora 皆様アドバイスありがとうございます。 A付加に用いる酵素はBlend Taqでもいいのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4151-7 - 2015/06/03 (水) 10:04:49 - 〜 お金に余裕があれば、blunt endでもそのままクローニングできるTOPO cloningもありかと思う。

(無題) 削除/引用 No.4151-6 - 2015/06/03 (水) 09:58:09 - DMSO 私もTaqかキットを使用したA付加がほぼ一択だと思います。 ところで、あまりやる作業ではないのですが…… PCR産物をテンプレート、同じプライマーを使用したPCRってうまくいかないですよね…… 以前も調べたのですが、口コミをちょっと調べてみました。 http://www.protocol-online.org/biology-forums/posts/22708.html http://www.researchgate.net/post/Any_problems_using_the_same_primer_set_twice 最初のPCRでプライマーダイマーやら電気泳動で目に見えないプライマー由来の産物が結構あって、それがテンプレートになってシステムが消費されると考えるのが一番リーズナブルですかね？もしそうなら、普通のPCRで40サイクルとか回しても、後半ほとんどゴミしか増えていないということですかね？たしかにリアルタイムPCRの結果を見るとそんな気もしますが。

(無題) 削除/引用 No.4151-5 - 2015/06/02 (火) 22:28:47 - おお わたしもせっかくKOD Plus neoでバンドがでたんだから、Aを付加するだけでいいと思う。

(無題) 削除/引用 No.4151-4 - 2015/06/02 (火) 21:56:40 - cDNA dNTPmixでも出来るのですが、より確実にdATPを使います。 以下のプロトコール（10ページ）を使ってます。 http://www.promega.co.jp/jp/jp_tech/jp_manuals/pgem-t.pdf

(無題) 削除/引用 No.4151-3 - 2015/06/02 (火) 19:26:44 - tora アドバイスありがとうございます。 不勉強で申し訳ないのですが、TaqでAだけ付加するというのは、PCRではなく、TaqとdNTPmixtureを回収したサンプルに混合し、反応させるということですか。 詳しいプロトコルを教えていただけるとありがたいです。

(無題) 削除/引用 No.4151-2 - 2015/06/02 (火) 19:05:18 - cDNA 質問の答えじゃなくて申し訳ないですが、TaqでAだけ付けたらだめなんですか？私はTAクローニングの時にはそうやっています。

2ndPCRについて 削除/引用 No.4151-1 - 2015/06/02 (火) 18:42:14 - tora 2ndPCRについてお聞きしたいことがあります。 約1.3kbpの遺伝子のクローニングを試みています。初めからBlend Taqを使用するとバンドが得られなかったので、まず正確性の高いKOD Plus neoでPCRを行い、TAクローニングを利用するためにBlend Taqを用いて2ndPCRを行いました。 すると1stPCRでは得られていたバンドが、2ndPCRではスメアを引くぼやけたバンドになってしまいました。師匠に聞くと、バンドが非特異なものか、2ndPCRのtemplate濃度が高すぎる為ではないかと言われました。 そこで、質問なのですが、今回の様に正確性の高い酵素から低い酵素へと酵素を変更して2ndPCRを行うことは可能なんでしょうか。nestedPCRを行い、バンドが確認できたので、非特異的増幅ではないと考えており、今回の様な手法に問題があるのではと考えています。 皆様アドバイスお願いします。

全12件 ( 1 〜 12 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---