全4件 ( 1 〜 4 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.4140-4 - 2015/06/01 (月) 16:03:28 - ats Betaine+DMSOが効果的だったのは、凍結融解のダメージが少ないからだと思う。 もう一つ、SOC回復培地の代わりに、使用期限がすぎたRPMI1964培地（血清不含）があったので試してみたら、効率が約1.5倍良かった。アミノ酸が効くのかな？

(無題) 削除/引用 No.4140-3 - 2015/06/01 (月) 15:49:15 - lalson 早速のご返事、ありがとうございます。 Betaineは試したことがありませんでした。 早速やってみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.4140-2 - 2015/06/01 (月) 12:18:39 - ats 要は、高効率のElectroporation用Competent Cellを調製する方法ですね。 BACライブラリーでの経験はありませんが、Tipsが参考になれば。 (1)培養は低温(18-22℃）が望ましい（凍結保存等のストレスに強くなるのかな？）。 37℃高塩濃度培地という論文もあったが、増殖が遅い、洗浄が面倒だった。 (2)フラスコ容量の1/10-1/7の培地量を用いる。バッフルフラスコならより良い。ファーメンターも使用可能。 (3)バッフルフラスコを使用する場合、消泡剤A204(1L に50uLほど:オートクレーブ可能）なら効率に影響はない。 (4)OD=0.2-0.4に達したら氷冷水で急速に冷却する。 (5)それ以降の作業は4℃以下を保つ（チューブ、ローター、遠心機等も含めて）。 (6)洗浄回数は少ない方が良いので、塩が少ないSOB(Mg不含）培地やNaCl無しLB培地を用いる。NaCl無しLB培地だとやや増殖が遅いかも。 (7)洗浄回数は少ない方が良いので、1回目の洗浄には、培地量の1/2-1/1の洗浄液（保存液）を用いる。上手に行えば、１回の洗浄で十分でパルスの半減期t1/2=4.8-5msecほどになる(50uL/2mm gap)。 (8)最終的にOD=150-200にする。 (9)凍結保存しないで調製日に使用する方が効率が高い。 (10)10%Glycerolより、0.3M Betaineで洗浄＞5-10%DMSO+0.3M Betaineで凍結保存の方が効率が良かった。 (2)(3)(10)以外はネットで拾った情報ですが、ご自身の環境で確かめてください。

BAC用のコンピテントセル 削除/引用 No.4140-1 - 2015/05/31 (日) 23:33:59 - lalson 初歩的な質問ですみません。 現在、BACライブラリー構築の際に市販のコンピテントセル（DH10等）を使っております。もし、自分で作成したコンピテントセルでBACライブラリーを作製されておられる方がいれば、そのコンピテントセルの作成法をお教え願えませんでしょうか。

全4件 ( 1 〜 4 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---