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ありがとうございます 削除/引用 No.414-7 - 2012/05/24 (木) 10:17:52 - 培養初心者 投稿した日からだいぶ経て、もうご意見を伺えないものとばかり 思っておりましたが、貴重なご意見を賜り、感激しております。 HUVECはLONZAのHUVEC-EGM2で培養し、P2で大量にストックを作りました。 培地+10%FBS+10%DMSOで保存しましたが、特に問題なく起きました。 実験についてはまず、添加キットを全て入れて実験しましたが、結果は芳しくなかったです。内皮の炎症マーカーなどをみるため、ステロイドなどが入っている添加キットでは厳しいかなと思いました。 一度0.2％血清での実験もやってみたいと思います。 ありがとうございました。

削除/引用 No.414-6 - 2012/05/24 (木) 07:35:16 - どん兵衛 �@についてはpsan産と同様、セルバンカーで普通に凍結して使用していますが、内皮機能などを測定した結果は凍結しないものと比較して落ちているというような経験はありません。むしろ起こした細胞を増やしてから凍結し、実験の度に起こしてpassageをそろえたもので実験するようにしています。 �A完全無血清だと若干機能に影響がでるので古典的な0.2％血清を使用しています。BSAを入れる方法もありますが、やったことはありません。 それと”自分で細胞を起こした培養皿はP1”というのは間違いです。Lonzaの場合にはその細胞の基本情報（人種、性別、継代数）などが添付されている文書に記載されています。

LonzaのHUVEC 削除/引用 No.414-5 - 2012/05/23 (水) 23:30:57 - psan 当方も、培養に慣れてはおりませんが、やはり必要あってLONZAのHUVEC-EGM2で培養をしております。 �@取り扱い説明書には、細胞は再凍結して使用しないこと とありますが、凍結保存してはいけないということでしょうか。 これは、凍結した場合にはLonza社の公表データ（分裂回数、増殖速度など） を保障できない、ということだと理解しています。 Lonza側としては凍結は勧めていませんが、そうも言っていられないので。 こちらはセルバンカーで凍結しています。 �Aブレットキットには様々な添加因子が入っており、 各種薬剤ふりかけ実験をする際には、抜くか、他のDMEM(high glucose,low glucoseなど)などでも可能なのでしょうか。DMEMなどではFBSを入れないか、EGMのような2%入れるか、通常の培養のように10%入れるかはいかがでしょうか。数日培養するのは厳しいかもしれませんが、一日くらいまでならどうでしょうか。 こちらは当方もふりかけ実験の条件検討中です。ただ、血清なし、添加因子なしでは、数時間も持ちませんでした。単に抜く(ＥＢＭ−２の組成にする)だけでは駄目なようです。余りよく知らないので大きなことは言えませんが、もともとの培地に入っている血清が2%ですから、それを減らすことはあっても多くするのはどうかなぁと思います。 便乗ですみませんが、主さまのその後の経過や他の方のご意見も伺えればと思います。

Lonzano 削除/引用 No.414-4 - 2012/05/23 (水) 23:21:22 - psan

早速のお返事ありがとうございます 削除/引用 No.414-3 - 2012/04/16 (月) 14:09:58 - 培養初心者 丁寧な返信を頂き、誠に恐縮しております。 早速細胞を起こして、ストック作りを頑張りたいと思います。 実験も一日以内の系を考えていますので、添加因子なしで、血清もなしで 結果が上手く出るか、早速試してみます。

(無題) 削除/引用 No.414-2 - 2012/04/16 (月) 11:07:20 - toyo 以前一度だけHUVECでEGF添加実験をしたことがあります。 専門ではないのですが、参考までに。 �@について、私の実験にはラボの凍結ストックを起こして使いました。 細胞の量が必要で資金がない場合は仕方ないと思いますが、 継代(分裂数)により変化・劣化していくような性質を題材に 実験する場合には、毎回購入するしかないのかなと思います。 質問者さんの実験の対象に依存する問題のように思います。 凍結保存にはCellBanker (バンバンカー)を使用していましたので、 培地+10%FBS+10%DMSO で大丈夫かどうかはわかりません。 �Aについて、EGF刺激実験の際には、基本培地は通常培養時と同じで、 EGFと競合する成長因子や血清などは添加せずに血清飢餓を行いました。 >初代培養細胞を買って、自分で細胞を起こした培養皿はP1 これは定義の問題だと思います。 メーカーによっては初代から数回分裂したものをプールして 供給していると明示しているところもあると思います。 細胞の分裂回数が後でフォローできるように、番号付けの 定義が明示されていればよいのではないでしょうか。

HUVECの培養につき 削除/引用 No.414-1 - 2012/04/14 (土) 13:10:01 - 培養初心者 細胞の培養に慣れてきた、大学院生です。 今までBAEC(ウシ大動脈内皮細胞)で予備実験をし、 その結果をもとにHUVEC(ヒト臍帯静脈内皮細胞)で実験するように担当教官から言われました。 LONZAのHUVEC-EGM2で培養をしようと思っております。 そこで、色々読んでみますと、2点分からないことが出てきました。 �@取り扱い説明書には、細胞は再凍結して使用しないこと とありますが、凍結保存してはいけないということでしょうか。 継代数 P2からP4で使用するのですが、なかなか保存しないと厳しい気が するのですが。培地+10%FBS+10%DMSOで保存できればいいなぁ思います。 �Aブレットキットには様々な添加因子が入っており、 各種薬剤ふりかけ実験をする際には、抜くか、他のDMEM(high glucose,low glucoseなど)などでも可能なのでしょうか。DMEMなどではFBSを入れないか、EGMのような2%入れるか、通常の培養のように10%入れるかはいかがでしょうか。数日培養するのは厳しいかもしれませんが、一日くらいまでならどうでしょうか。 担当教官もHUVECの培養はしたことがなく、聞いても不機嫌になるだけでした。他の論文もM-199に添加因子を入れていたり、薬剤ふりかけの際のmediumを書いていなかったりで、困っております。どなたかお知恵をお授け下さい。 最後に基本的な質問で甚だ恐縮ですが、初代培養細胞を買って、自分で細胞を起こした培養皿はP1ということで宜しいんですよね？ 合わせてお答え頂けると幸甚です。

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