いつもコメントありがとうございます。
>[Re:4] おおさんは書きました :
> SDSいれて複合体をIPしている人もいますね。detergentの選択は蛋白やそのinteracterによって多様な選択しがあるとおもいます。なにを基準にして決めるかは研究者しだいです。たとえば複合体に活性がある状態でIPできるものをえらぶとか、既知のものがcoIPされる条件でIPするとか、期待されないノンスペが検出されない条件にするとか。
私も、何を基準にして決めるか研究者しだい、センスしだい、だと思います。
私の今の基準は、『ターゲットは既知だけど、とある薬剤を細胞に作用させたときにみられるまったく新規の現象に関わるタンパク複合体（その既知ターゲットを中心とする）の精製』です。
ですので、できるだけその状態を模倣したIP条件でコンプレックスを精製したいのです。
でも、きっとどんな条件であれ、IPすればコンプレックス”もどき”は取れてくるわけで
IP条件、もっと言うと、lysate、binding buffer, washing bufferに用いるバッファー組成を
どのように極めるか、で悩んでるのです。一端、結果を得ると、それに引っ張られて先々の
方向性が決められていってしまうので。
最終的には、えいや、で決めないといけないんでしょうけど...。
> 抗体ビーズからreleaseするのに還元剤は気になるなら入れなくていいですよ。
これも考えたことあるのですが、効率よくeluteできないんじゃないか、S-S切らないことで複合体構成成分の見落としがあるんじゃないか、とか思ってしまって、まだ試してません。。。
つまり、いろんなケースはできるだけ考えているのですが、考慮すべきファクターが自分の中で膨大で優先順位をつけられずにいる状態です...、お恥ずかしながら。
あぁ、優柔不断な自分。。。
逆にいうと、マスペックでの解析を目指すなら、やっぱりIPで使った抗体がeluateに入ってると
かなり邪魔になるってことでしょうか。 |
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