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(無題) 削除/引用 No.4138-28 - 2015/06/08 (月) 16:18:09 - asan IP後直接MSに持ち込むのか、MSはMALDI/TOFなのか、LC/MSでオンラインで直接測るのかによってもちょっと色々変わってきますかね。 初心者に一番やりやすいのは普通にサンプルバッファーボイルで溶出して、SDS-PAGEをして銀染かCBBで目的のバンド(あるいは全面）を泳動パターンを見ながら切り出し、ゲル内消化でMS測定する方法です。これならIgGの被る場所を意図的に除いたりすることも出来ますし、MS側の機械に負荷がかかりすぎたり、ビースをコンタミさせるという危険性は回避されます。一応、特にヒト由来のサンプルの場合はケラチンのコンタミを避けるためにPAGEはかなり綺麗なものでやる必要はあります。 直接MSに持ってく場合は、detergent（SDSだけじゃなくてNP40,Tritonも含む）がイオン化に問題なのでWashでこういうのをちゃんと除く必要がありそうです。in solutionで消化する場合、良くあるのはon beadsで消化する方法ですが、結構コンディションが難しいとか聞きます。自分は、やった事ないですが。この場合は、原理的にはこのままバッファーを飛ばしてMS/MSに持ち込めても見えないbeadsを持ち込まない保証はないので、脱塩tip等を行ってから測定が無難ですね。サンプルが微量の場合は脱塩のステップの吸着でいなくなる可能性もありますけど。 DMP かDSSでクロスリンクはリン酸化抗体なんかで良くやられます。この場合直接MSに持ち込むなら酸で溶出する方法が良く取られます。 いずれにせよMSも機械との相性とか、測定者の得意な測定方法とか色々あるので、測定する機械、サンプル量などを含めて、測定してもらう方に一応相談してからが良いと思われます。

(無題) 削除/引用 No.4138-27 - 2015/06/05 (金) 01:27:21 - ５５８ そういうユーザーのために、抗体を直に共有結合できるビーズ売ってるよ。

(無題) 削除/引用 No.4138-26 - 2015/06/03 (水) 23:29:06 - F みなさん、いろいろとアドバイスありがとうございました。 参考にさせてもらい、条件検討を地道に続けていきたいと思います。 ちなみに、バッファの検討をしてるんですが、今日出た結果は、目的タンパクの可溶化が RIPAに比べて著しく低いということでした。。。 あまり洗剤入れたくない気もするし、でも、それに確たる根拠があるわけではないし、 なかなか悩ましいところではあります。。。 がんばりまーす

(無題) 削除/引用 No.4138-25 - 2015/06/01 (月) 06:10:27 - おお http://www.pnas.org/content/111/26/9455.full ぐぐるとそれなりにみつかりますね。。。

(無題) 削除/引用 No.4138-24 - 2015/06/01 (月) 05:15:29 - おお 実はですね、クロスリンクでMSっていうのはちょっと違う観点なんですけど考えたことがあってですね。。。そんなこと考えているときに、どっかの業者がそんな感じのリーフレット持ってきてたようなきがする。。。 ああ、あてにならないじょうほうだなぁ

(無題) 削除/引用 No.4138-23 - 2015/06/01 (月) 03:50:29 - mon > おもしろいクロスリンカーないかなぁ。 IPで汎用されるのはS-S結合を有するDSPやその類似体だと思いますが、リジン・アルギニンを修飾するのでMSにはいかがなものかと思います。修飾されたアミノ酸を解析ソフトが検出できれば良いのでしょうが、この辺りはMSの専門家に聞かないと。。。

(無題) 削除/引用 No.4138-22 - 2015/05/31 (日) 10:27:24 - F >[Re:21] おおさんは書きました : > NCBIにも各遺伝子(蛋白)に対するbiding partnerがリストでのっていてuniprot と同じようなデーターベースに飛べるようなリンクがあったとおもいましたが、、、 はい、それでみてました。 言葉足らずでしたが、たとえば、The Human Protein Atlasみたいな媒体で、 網羅的なinteractorsのデータベースがあるのかな、と思ってきいてみた次第でした。

(無題) 削除/引用 No.4138-21 - 2015/05/31 (日) 08:32:19 - おお >[Re:18] Fさんは書きました : > ウニプロットなんですね。いつもは大体NCBIで済ませてました。。 > このへんのデータベース、いろいろありますが、それぞれの特徴とかよくわからないし、 NCBIにも各遺伝子(蛋白)に対するbiding partnerがリストでのっていてuniprot と同じようなデーターベースに飛べるようなリンクがあったとおもいましたが、、、

(無題) 削除/引用 No.4138-20 - 2015/05/31 (日) 08:25:20 - F monさん、コメントありがとうございます。 >[Re:17] monさんは書きました : > > それよりは、いかにしてintactなコンプレックスを取ってくるか、で悩んでいる次第 > もしかするとクロスリンカーも最近なら使える手法もあるかも？ そうなんです、クロスリンカーも妄想では考えたことあるんですが いかんせん、使用経験がないので、、、。ChIPとかRNA ChIP、CLIPとかですかね、 敢えて使用歴を述べると。でも、UVとか、formaldehydeです。。。 おもしろいクロスリンカーないかなぁ。 > 結構な濃度でペプチドを加える必要がありますので、MSかける前に取り除いた方が良いかも？ SDS-PAGEで流せば、ゲルから流れきるかと思ったんですが、やっぱりコンタミの懸念あるかも しれませんね。大体50残基ですので、110 Da x 50 = 5.5 kDaくらかな、と思っていたので。 でも、何事も理論通りにはならないもんで、高濃度ならレーンのどっかにいそうですよね、MSで 検出されてくるくらいは。検討します。

(無題) 削除/引用 No.4138-19 - 2015/05/31 (日) 08:17:37 - F ななしさん、貴重なアドバイスありがとうございます。 >[Re:15] ななしさんは書きました : > アフィゲルHzを使えば、Fc領域で抗体をカップリングできるので変な向きにはなりません。ただ、このタイプのmagnetが有るかはわかりません。 これ、知りませんでした。教えてくださいましてありがとうございます。 マグネットタイプはざっとみましたが、ありませんでした。 アフィゲルHzも検討してみたいと思います。 > > 文献は忘れましたけど、プルダウンでやると低速でも遠心によってかなりの細胞骨格系の蛋白質が混入してくるのでマグネットか、カラムを使った方が良いです。 なるほど、カラムの利点はこういうところにもありそうですね。 勉強になります。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.4138-18 - 2015/05/31 (日) 08:14:48 - F おおさん、ありがとうございます。 >[Re:14] おおさんは書きました : > http://www.uniprot.org/ > ここで適当に蛋白名をいれて > ウニプロットなんですね。いつもは大体NCBIで済ませてました。。 このへんのデータベース、いろいろありますが、それぞれの特徴とかよくわからないし、 あまり突っ込んで調べてませんでした。怠慢ですねぇ...。 これを機会にいろいろきっちりみてみようと思います。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.4138-17 - 2015/05/30 (土) 13:01:10 - mon > それよりは、いかにしてintactなコンプレックスを取ってくるか、で悩んでいる次第 もしかするとクロスリンカーも最近なら使える手法もあるかも？ > 抗体認識配列ペプチドを入れてeluteできるか 基本的には出来ますが、効率は抗体によります。親和性の高い抗体ほど外れにくい（peptideと入れ替わりにくい）です。 結構な濃度でペプチドを加える必要がありますので、MSかける前に取り除いた方が良いかも？ また、pH4-5ほどのややマイルドな酸性溶出液とかエチレングリコール、チオシアン酸カリウム（KSCN）、ジオキサン等の疎水性相互作用を弱めるものを含む溶出液とペプチドを併用すると良いかもしれません（経験がないので無責任モード）。

(無題) 削除/引用 No.4138-16 - 2015/05/30 (土) 10:47:29 - おお シュークロースやグリセロールである程度以上の密度にしておいて、おもいものにつけた抗体を遠心でおとすと見かけノンスペと思われる夾雑物ものぞけるのでいいという人がいました。そのひとはgold particleがどうこうといってましたが、マグネットビーズも重そうだからできるんじゃないかなぁ。

(無題) 削除/引用 No.4138-15 - 2015/05/30 (土) 10:36:25 - ななし アフィゲルHzを使えば、Fc領域で抗体をカップリングできるので変な向きにはなりません。ただ、このタイプのmagnetが有るかはわかりません。 文献は忘れましたけど、プルダウンでやると低速でも遠心によってかなりの細胞骨格系の蛋白質が混入してくるのでマグネットか、カラムを使った方が良いです。

(無題) 削除/引用 No.4138-14 - 2015/05/30 (土) 10:08:00 - おお >このデータベースってなんというものでしょうか？ たとえば http://www.uniprot.org/ ここで適当に蛋白名をいれて http://www.uniprot.org/uniprot/Q9NY61 ここのInteractionの欄でこのページ上にもいくらかのってますが、Protein-protein interaction databasesのカラムにリンクが張ってあってもう少し詳しい情報がえられます。

(無題) 削除/引用 No.4138-13 - 2015/05/30 (土) 08:51:33 - F コメントありがとうございます。 >[Re:11] monさんは書きました : > 経験豊富なMS/MSの専門家に相談はされましたか？ > というのは、IPだけではMSの感度が良いので、軽く20種を超えるいろいろなタンパクが同定されて本物はドレ？という状況になりえます。微量だからノンスペと言えないのも悩ましい。 おっしゃるとおりだと思います。 方法論としては、下のほうの別のコメントにも書きましたが、細胞にとある薬剤を作用させたときに ターゲットタンパクを中心としたタンパク複合体がどのように変化するか、を見極めたいので 薬剤ある/なし、またnegative controlとして使えそうな薬剤もあるので、ノンスペの懸念は だいぶんましかなと思ってます。それでも悩むことになるでしょうけど。。 それよりは、いかにしてintactなコンプレックスを取ってくるか、で悩んでいる次第です。 > peptideを使った抗体からの溶出でもそうなります（同僚が経験あり：PBS-tritonX100で溶解、PBS-teen20で洗浄、DYNA-beads使用）。 使用する抗体の認識配列がわかっている（マニュアルに書いてある）ので、FLAG-tagタンパクの 溶出にFLAG peptideを用いる要領で、抗体認識配列ペプチドを入れてeluteできるかな、と 思ったんですが、あんまみたことないので、収率が悪いのかなと思ってました。 原理的にはいけそうなんですが、実際のところいけますか？？ > detergentに関して気になるなら使わない事です。溶出も抗体を共有結合せたビーズから酸（orアルカリ）溶出させれば良いですが、それでもMSで（微量の外れてきた）抗体が検出されます。 > IPにアガロース系ビーズを用いるとより酷いです。親水性表面のポリマー系magnetic beadsが良いようです。これには二つの利点があって、beadsそのものへの非特異吸着が少ない、壁面に吸着させて回収するため（不溶物のような）沈殿物を取らないので不純物が大幅に減ります。 はい、magnetic beadsを使って条件検討してます。おっしゃるように、バックグラウンドが ほとんどなくて（CBB染色）感動しています（笑、ほんとに。今まではsepharose beadsを ずっと使っていたのですが。

(無題) 削除/引用 No.4138-12 - 2015/05/30 (土) 08:26:09 - F アドバイスありがとうございます。 >[Re:10] おおさんは書きました : > 理想的なのはその現象に付随する何かがcomplexに反映されているかを見極めることかと思います。網羅的なinteracterのデーターベースはありますので、そのなかからその現象に反映しそうなものがIPで取れてくるかなどの条件をさぐるとか。 このデータベースってなんというものでしょうか？教えていただけると大変ありがたいです。 > > lysateをゲル濾過などのクロマトでわけて特異的なプロファイルがみれるならそういうlysateの取り方でやってみるとか、局在がかわるならそういうinformationも使えるかもしれないですし、いろんなアプローチが可能なのでいろいろと考えてみるといいかと思います。 いろいろあって、困ってるというか、逆に楽しいというか。考えて考えて、えいやーでいきます。

(無題) 削除/引用 No.4138-11 - 2015/05/30 (土) 07:12:46 - mon 経験豊富なMS/MSの専門家に相談はされましたか？ というのは、IPだけではMSの感度が良いので、軽く20種を超えるいろいろなタンパクが同定されて本物はドレ？という状況になりえます。微量だからノンスペと言えないのも悩ましい。 peptideを使った抗体からの溶出でもそうなります（同僚が経験あり：PBS-tritonX100で溶解、PBS-teen20で洗浄、DYNA-beads使用）。 資金・マンパワーが豊富なら片っ端から抗体を購入して相互作用を検討することも出来なくは無いですが。 ですので、Negative controlの設定が重要になります。 detergentに関して気になるなら使わない事です。溶出も抗体を共有結合せたビーズから酸（orアルカリ）溶出させれば良いですが、それでもMSで（微量の外れてきた）抗体が検出されます。 IPにアガロース系ビーズを用いるとより酷いです。親水性表面のポリマー系magnetic beadsが良いようです。これには二つの利点があって、beadsそのものへの非特異吸着が少ない、壁面に吸着させて回収するため（不溶物のような）沈殿物を取らないので不純物が大幅に減ります。

(無題) 削除/引用 No.4138-10 - 2015/05/30 (土) 01:00:59 - おお >逆にいうと、マスペックでの解析を目指すなら、やっぱりIPで使った抗体がeluateに入ってるとかなり邪魔になるってことでしょうか。 方法論によると思います。 IgGが入った状態で電気えいどうして、興味あるバンドを切り出して同定するとか。 どういう風にcomplexをとるかは確かにセンスだとおもいますが、人によってはあまり考えずにえいやーっとやってしまう人もいますしそれが悪いともいいません。 理想的なのはその現象に付随する何かがcomplexに反映されているかを見極めることかと思います。網羅的なinteracterのデーターベースはありますので、そのなかからその現象に反映しそうなものがIPで取れてくるかなどの条件をさぐるとか。 lysateをゲル濾過などのクロマトでわけて特異的なプロファイルがみれるならそういうlysateの取り方でやってみるとか、局在がかわるならそういうinformationも使えるかもしれないですし、いろんなアプローチが可能なのでいろいろと考えてみるといいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.4138-9 - 2015/05/30 (土) 00:22:44 - F コメントありがとうございます。 >[Re:5] dmさんは書きました : > Protein G beadsと抗体を結合させた後に、DMPなどで架橋する方法があります。 > これだと分子間架橋なので、抗体内部も架橋されるでしょう。 > 抗体の認識性が変わるかもしれないので、確認が必要だと思います。 > そういった架橋剤があるとは知りませんでした。貴重な情報ありがとうございます。 抗体の認識性のチェックは、架橋剤あり/なし、でIPして、ターゲットタンパクが ウェスタンブロッティングで出てくるか、を確認すればよいんですよね。 試してみます。 > 細胞質のタンパク質であれば、RIPAを使う必要はないと思いますよ。 > 膜タンパク質でも、ものによっては弱い界面活性剤でも大丈夫なはずです。 先にも書きましたが、ターゲットタンパクは既知で文献的には細胞内局在は比較的よく 研究されているのですが、私がみたい現象がまったく新しいので、局在dependentな bufferを正直に使用するのに躊躇しているところです。 考えれば考えるほど、難しいです。。。

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