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(無題) 削除/引用 No.4133-12 - 2015/05/28 (木) 14:31:52 - おお 蛋白量は10-20ugというのは確かにそれぐらいの方がいいと思えますが、ゲルの厚さなども関係してくるし、参考にするにしてもその辺も考慮した方がいいかと思いました。ちなみに0.75mmのミニゲルで20ugぐらいがmaxかなと思います。もちろんそれ以上乗せれないことはないですけど。1.5mmだと40ugでも何とか流せるんじゃないかと。100ugぐらい乗せる人も文献見るといるようです。 あとサンプルによって発現量も違うだろうし、抽出バッファーによっても全体の蛋白量に対するターゲットの量が違うのでその辺をつめないと20ugで本当にうまくいくのかという意味で不安要素がかなり消去されずにのこっている状態だとも思えます。 標準プロとコールはメタノール20%で10%はそれぐらいでいいかもと思います。たいてい250kDa越えたあたりから、5%に下げるかどうか思案しはじめることがあります。20VぐらいでONでやると高分子も比較的効率よくtransferされるという話もあります。たしかにゲルのtopにうっすらバンドが短時間でtransferした後の染色でみえますが、それがO/Nではないです。 まあどんな状態か想像できませんので(バンドの形状とか今イチ想像しているのがあたっているかわからないですし)、お考えになった方法で一度やってみるといいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.4133-11 - 2015/05/28 (木) 13:25:30 - しろ うちは転写は20％メタノールです。（バイオラッドの10Xと水とメタノールを混ぜる。sdsなし。）過去の結果を見直しましたが、特に問題なくバンド出せてました。トータルはくっきりと、フォスフォは若干薄いですが、さほど問題とも感じないくらいです。ほかのバンドは出ているとのことですから、何ででしょうね？

(無題) 削除/引用 No.4133-10 - 2015/05/28 (木) 12:30:45 - IP ありがとうございます。 とりあえずはしろさんのプロトコルを試してみたいと思います。 ちなみに転写緩衝液のメタノール濃度は10%です。高いのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4133-9 - 2015/05/28 (木) 07:37:47 - 中年 アクチンとmTORでは分子量が全く違うので、アクチンが検出できても高分子量領域のトランスファーが大丈夫とは言えないでしょう。トランスファー中にメンブレンが浮くと言っても、もちろん全体が浮く訳じゃなくってメンブレンの端が少し浮く程度ですよ。 同じメンブレン、同じレーンで、同じくらいの分子量の他のタンパク質がきれいに検出できることがリプローブで確認できたというなら分かりますが。

(無題) 削除/引用 No.4133-8 - 2015/05/28 (木) 01:12:44 - しろ 他のバンドが出ているということは一次抗体に問題があるのでしょうか。泳動のバッファーが古かったり温度が高かったり泳動スピードが速すぎたりすると高い位置のバンドがヘニャッと曲がってしまったりもやっとしてしまうことはありました。新しいバッファーでゆっくりめに、泳動のボックスを氷につけながら（冷やして）流すときれいに横一線のバンドになりましたが。プロテイン量は10から20マイクログラム、10%ゲル、ウエットでトランスファーがうちの標準です。

(無題) 削除/引用 No.4133-7 - 2015/05/28 (木) 00:54:14 - おお transfer bufferのメタノールはなん%でしょうか。全体的に蛋白がうまく移っているようなばあいでも、蛋白ごとにゲルからの溶出しやすさが違いますので、、、なのでメタノール濃度を下げたりして少し溶出効率をあげてやるといいかもしれません。微量SDSをバッファーに加える人もいますけど、、、

(無題) 削除/引用 No.4133-6 - 2015/05/28 (木) 00:09:36 - おお ああ、たまにそう言う感じのありますが、そんなに醜いですかね、、、検出感度が足りないから微妙なムラとかで部分的にHRPが反応してるのかもしれません。レーンの両端が点のように染まっているということはないですか?

(無題) 削除/引用 No.4133-5 - 2015/05/27 (水) 23:52:22 - IP 皆さんありがとうございます。 転写や泳動はうまくいっているようなのですが(メンブレンやゲルの染色、同一メンブレンでのアクチンの検出で確認しています)なぜかmTORだけが出てくれないのです。 ノンスペと被ってるわけでもなく、ひとつひとつを繋ぎ合わせればひとつのバンドになるであろう染みが細かく出るような感じです。

(無題) 削除/引用 No.4133-4 - 2015/05/27 (水) 23:47:28 - おお 他の研究室のデーターと比較しているようですが、それらも7%のゲルでのデーターでしょうか。 ノンスペがバンドにかぶっている可能性はないですか?条件など少しキツくしてみてはどうでしょう。 transferのあと蛋白の転写具合を膜を染めて確認していますか?

(無題) 削除/引用 No.4133-3 - 2015/05/27 (水) 23:26:13 - しろ CST抗体でmTORのウエスタンの経験がありますが、特に問題なくバンドは出ました。プロトコールの問題でしょうかね。アクチンなど、同一メンブレンで他のバンドは出ますか？

(無題) 削除/引用 No.4133-2 - 2015/05/27 (水) 21:29:09 - 中年 バンドが分散というのがどういう様子を指すのか分かりませんが、単にトランスファーの失敗ではないでしょうか。ウェット式で４時間だと、気を付けないとメンブレンが浮くことがあります。 「同じ条件」で同じくらいの分子量の他のタンパク質がきれいに検出できているとのことですが、「同じ条件」ではなくて「同じメンブレン」ではどうですか？

Western blottingでmTORが検出できない 削除/引用 No.4133-1 - 2015/05/27 (水) 19:12:52 - IP Mammalian target of rapamycin (mTOR)のWestern検出についてです。 1wellあたり40μg protein、7%アクリルアミドゲルでSDS-PAGE、Wet式transfer（緩衝液はCAPSをベースにしたもの）を4時間の条件でmTORとphospho-mTORの検出を試みています。しかし、バンドが分散したような形になり（バンドの体をなしていません）、検出ができません。 分子量が大きいからかなとも思いましたが、同じくらいの分子量のタンパク質は同じ条件で検出できています。また、論文や学会で見てもかなり綺麗にバンドが見えているチームが多いので、プロトコルに問題があるのではないかと考えています。 一次抗体はいずれもCSTのものを用いています。 宜しくお願いします。

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