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(無題) 削除/引用 No.4132-7 - 2015/05/27 (水) 14:42:36 - おお 多くのせるとわたしもやはり夾雑物の心配をしてしまいます。TBなどリッチな培地を使わないようにと書いているのもあったと思いますが、培地の問題じゃなくて大腸菌の数の問題で夾雑物が増えるとかそう言うてんで保証がないのかなと思ったのですが、、、 一度キットを使わずそ精製してからカラムに載せるという工夫をしている人はいるようですが

(無題) 削除/引用 No.4132-6 - 2015/05/27 (水) 10:04:44 - 7744 もし大腸菌を大過剰量に用いた場合、中和液を入れた後、通常のような白いカスのようなものは出てこないか、いつもと違う状況になります。 キアゲンだと中和してから遠心するのだと記憶しているのですが、それまでの過程で何もおかしなことが見られなかったのであれば、プラスミドの回収はできているはずです。 それなりに見ている人であれば、絶対に気付く程度のおかしさになります。 ただ、エンドトキシンなどの不純物の量はキアゲンの保証濃度を超えてしまっている可能性はあると思います。 ちなみに、プラスミドの回収という観点のみからすると、キアゲンのキットも他社のキットも、マニュアル記載の量の２倍以上は余裕で回収できますよ。

(無題) 削除/引用 No.4132-5 - 2015/05/27 (水) 07:35:21 - 独り言 大腸菌をオーバーロードするとエンドトキシンなどの不純物のコンタミが増加するのだろうとおもっています。

(無題) 削除/引用 No.4132-4 - 2015/05/27 (水) 06:18:47 - ats 他メーカーのものを使用していますが、マニュアル記載の最大量(200ug)の2-3倍（希に5倍）のplasmidがとれています。 ただし、バッフルフラスコ（培地量は容量の1/10-1/7)＋TB培地を利用し菌体量を多くして、アルカリSDS溶菌に使用するI~III液量を増やして、カラムにロードしています。またカラムへの負担を減らすため菌体沈殿をDDWでリンス（懸濁はしないで再遠心）、III液を加えてから37℃で30分以上保温(I液由来のRNaseをしっかり効かす）、遠心してデブリを粗方取り除いてからプレフィルターにロードしています。洗浄液量、溶出液量は規定通り。 ゲノムDNAのコンタミはほとんどの場合問題になりませんが、RNase処理が不十分だと溶出plasmidに混入してきますので注意（OD260/280の値に注意）。この場合、PEG/NaCl沈殿（+再度のEtOH沈殿）すればRNA分解物は除去できます。

(無題) 削除/引用 No.4132-3 - 2015/05/27 (水) 02:40:33 - yyy 収量と言うのはカラムがDNAを結合する濃度に依存しているので、単にキットのカラムの結合能を記載してるのだと思います。だからMidiキットを使って500mlのスケールからプラスミド精製しても大部分は結合出来ないで無駄になるので意味が無い、ということだと。ゲノムDNAはカラムを通す前に除去されてるはずですよね？　それと、カラム以外にも使用する溶液の量も関係してきますか。大抵は培養液の量に応じて増やしてやれば対応出来ますが、上述の問題で意味が無いと思います。 　これまでの経験だと、カタログに記載された量よりもう少し多くのプラスミドが回収できるのが普通で、170ugくらいなら取れても良いと個人的に思います。 　ゲノムかどうかはおおさんの御指摘の通り泳動すればわかるかと。

(無題) 削除/引用 No.4132-2 - 2015/05/27 (水) 00:05:11 - おお ゲノムだったら電気えいどうすればわかるでしょう。最大というのは、それ以上はいろいろないみで保証しないということではないかと思います。

QIAGEN の plasmid 抽出キットの最大収量を超えた場合について 削除/引用 No.4132-1 - 2015/05/27 (水) 00:00:01 - Dragon QIAGEN の plasmid 抽出きっとについて教えていただきたいと思い書かせていただきます。 Midi kit は最大収量が100ugとなっています。もしこれを超える量の大腸菌をオーバーロードすると、大腸菌などのゲノムが抽出されてしまうのでしょうか？ それとも、おもいっきり抽出量が落ちるのでしょうか？ 今、plasmidを抽出したのですが、計算すると170ug以上Midiキットでとれてしまっています。これはおかしいので、もしかしたらロードした大腸菌の量が多すぎて大腸菌のゲノムを抽出してしまったのではないかと思っています。

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