おおさん、cDNAさん、ありがとうございます。
＞SDSの話にしても、抽出方法、染色方法などが書かれていないと判断しようがないと思います。
不十分でした。情報を追加いたします。調製は以下の通りです。
1.SDS-page
2.リバース染色(アトーのEz-reverseというキットを使用)し、バンドを切り出す。
3. ゲルからタンパク質の抽出します。アトーのアトプレップというキットを使用。ゲルをクラッシュして、拡散法にて抽出します。タンパク質は、SDS-pageの泳動バッファーに抽出されます。さらにキットの中に、ポアサイズ0.2µｍ膜のスピンカラムが付いており、ゲル成分はそれで除去します。つまり、タンパク質は、やはり泳動バッファーに抽出されます。
4. スピンカラムタイプのゲルろ過で脱塩（アプロサイエンス社）
（脱塩後のサンプルをSDS-pageすると目的断片が確認できています）
5.ろ液を凍結乾燥
6.0.1％ギ酸、50％ACNに再溶解（学内のセンターが指定する溶媒）
7.ESI-MSへ依頼測定（カラムは通していません）
＞学内のセンター(？)からサンプル調製のプロトコールなどはもらえないのでしょうか？
学内のセンターの質量分析担当者は、質量分析のためのSDS-pageからのタンパク質調製はよくわからないとのことでした。常法に従ってみてくださいと言われた。。。
オービトラップで多価イオンで検出するということと思っています。
＞ゲルから溶出後そのままLC-MSに持っていけないかな、、、
そのままいけるかはわからないのですが、実験の目的を伝えたら、カラムを通さず、ESI-MSが良いのではないか、との提案でした。
記載忘れてましたが、タンパク質の断片のサイズは、10-15ｋDaくらいです。
LCには少し大きすぎるのではないかと思いましたが、いかがでしょうか。
よろしくお願いします。 |
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