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(無題) 削除/引用 No.4128-5 - 2015/05/27 (水) 12:27:36 - CC212 昨日5%スキムミルクでブロッキングし、本日検出したところ、ノンスペなしで検出できました。ご助言ありがとうございます。 あとは、サンプル間の差をより明瞭に見る必要があると思うので、処理時間やpuromycin添加のタイミング（処理の前か、後か、処理との同時添加か）が重要だと思うので検討を進めたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.4128-4 - 2015/05/26 (火) 20:59:42 - 東京ポスドク 特に問題なさそうな気がしますが、気になるのは以下の点でしょうか。 ＞分化させたC2C12を6時間無血清培養した後（mTORシグナルの活性を落とすためです）、puromycinを添加して30分後に20nMインスリンか10mMロイシンで処理しています。その30分後にサンプリングという流れです。 無血清培養した時点でbasalの蛋白合成はminimalになってはいないでしょうか？例えばGCN2によるeIF2aのリン酸化等。まずは血清ありなしでpuromycinを同量30分加えてみて、WBしてみるとどのぐらい蛋白が合成されているかが見えるように思います。我々はmilliporeのMABE343, clone 12D10を使いました。 ＞ブロッキングは3%スキムミルクで常温1時間。 5-10%まであげても良いかも知れません。我々は10％で行いました。

(無題) 削除/引用 No.4128-3 - 2015/05/26 (火) 11:32:54 - CC212 ありがとうございます。 分化させたC2C12を6時間無血清培養した後（mTORシグナルの活性を落とすためです）、puromycinを添加して30分後に20nMインスリンか10mMロイシンで処理しています。その30分後にサンプリングという流れです。 ブロッキングは3%スキムミルクで常温1時間。 1次抗体は4℃でオーバーナイトの条件です。 二次抗体で常温1時間反応後、TBS-Tで15分、5分、5分と計3回洗浄した後、ECL試薬を用いて検出しています。

(無題) 削除/引用 No.4128-2 - 2015/05/26 (火) 11:05:38 - 東京ポスドク 神経系の細胞で試しましたが普通に検出出来ましたよ。 通常のCell singalingのマウスの2次抗体で検出しました。 もう少し詳しい実験条件を書いて頂けますか？

SUnSET (puromycinを使ったタンパク質合成速度評価法）について 削除/引用 No.4128-1 - 2015/05/26 (火) 10:28:48 - CC212 　はじめまして。 　表題の通り、SUnSETを用いてC2C12細胞におけるタンパク質合成速度を評価しようとしています。 　ですが、論文のように綺麗にはいかず、ノンスペが若干多い状態です。洗浄が不十分なわけではないように思えるのですが、できるだけ綺麗に検出したいと考えています。 　心配なのが、二次抗体を一般的なHRP標識抗マウス二次抗体を用いています。SUnSET時には特別な二次抗体を用いているケースがあるとお聞きしたのですが、一般的な二次抗体でも問題ないのでしょうか。 　よろしくお願いします。

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