全24件 ( 21 〜 24 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. /2

(無題) 削除/引用 No.4112-4 - 2015/05/22 (金) 04:07:30 - おお >[Re:3] たなかさんは書きました : > >>おおさん > > ご意見ありがとうございます。 > 僕の中ではある程度意見が決まっているのですが、色々意見を聞いてみたいかなと > > 80-120%って8年位前の基準（TaKaRaのガイドブック）で、正直ゆるいですよね > （PCR機器によってはデフォルトQC基準が90-110%だったり） > あとはCq値が標的-リファレンス間で近いことですがこれも（±3以内とか）物によって基準が違って、結局明確な基準がないなーって印象です 精度は自分の実験の許容範囲ないで自身で決めるものでもあります。 > 実験の目的にもよるかと思いますが、同じ実験サンプルでも�刧僂tの結果とStandardカーブ法だとだいぶ結果が変わりますよね。論文では�刧僂tで3000倍誘導と書いてあっても実際にはProbeでもSYBRでもちゃんとやると150倍だったり 上がっていることがいえたらいい場合と、どれぐらい上がったかデーターが必要な場合とで違うと思いますが。前者ならこの条件で計算値として150倍上昇といえば、実際は3000倍でも結果としては変わらないわけだし。もしリアルの150倍と読む方がおもえばそれは読み方を間違っているとはいえるけど、かく方もミスリードにならないように気をつけることは大事ですけど。 > 個人的には�刧僂tは「定性」で考えていて、基本的にサンプル数やターゲットが多いわけでもないのに�刧僂tやってる論文はあんまり信用してません（Standardカーブ法でやっても殆ど手間は変わらないのに何故やるのかがあまり理解できない） 定性はあるかないかだけの話ですよね。ま、半定量的とはいえるかもしれません。半定量的が意味ないとはいえませんよね。 > > >>cDNAと合成DNAも違うといえば違いますよね。cDNAはRNAとの2重鎖になっている可能性がありますから。 > > そうですね。ここも合成DNAが検量線に使えない理由だなと思います 相対定量なら合成DNAでもいいと思いますけど?cDNAでも相対定量を考えているわけでしょ。 > > 一番知りたいのは自分の中にある8年前の常識(?)「結局、サンプル内から狙ってるものが一番高発現のものを段階希釈して検量線を作成するのが一番正確（同様なcDNAだから）」ってのが今も現役なのかってところです（ddqPCRは除く） 希釈も全体の核酸濃度などが変わるから性格にいうと同じ条件でサンプルと比べてませんよね。

(無題) 削除/引用 No.4112-3 - 2015/05/21 (木) 23:56:08 - たなか >>おおさん ご意見ありがとうございます。 僕の中ではある程度意見が決まっているのですが、色々意見を聞いてみたいかなと 80-120%って8年位前の基準（TaKaRaのガイドブック）で、正直ゆるいですよね （PCR機器によってはデフォルトQC基準が90-110%だったり） あとはCq値が標的-リファレンス間で近いことですがこれも（±3以内とか）物によって基準が違って、結局明確な基準がないなーって印象です メーカーが売ってるPrimerですが、「ほぼ100%PCR効率を確認済み」と書いてあっても「バリデート済み」とか「保証」ではないので、個人的には意味ないのでは？と思います だからこそ抜き取り検査までしててMasterを分注済みで送ってきてPCR装置まで指定しているPCRアレイでのみ現状メーカー保証が有るのかなと（二次微分解析ができればどんな装置でも変わらない気もしますが） 実験の目的にもよるかと思いますが、同じ実験サンプルでも�刧僂tの結果とStandardカーブ法だとだいぶ結果が変わりますよね。論文では�刧僂tで3000倍誘導と書いてあっても実際にはProbeでもSYBRでもちゃんとやると150倍だったり 個人的には�刧僂tは「定性」で考えていて、基本的にサンプル数やターゲットが多いわけでもないのに�刧僂tやってる論文はあんまり信用してません（Standardカーブ法でやっても殆ど手間は変わらないのに何故やるのかがあまり理解できない） >>cDNAと合成DNAも違うといえば違いますよね。cDNAはRNAとの2重鎖になっている可能性がありますから。 そうですね。ここも合成DNAが検量線に使えない理由だなと思います 一番知りたいのは自分の中にある8年前の常識(?)「結局、サンプル内から狙ってるものが一番高発現のものを段階希釈して検量線を作成するのが一番正確（同様なcDNAだから）」ってのが今も現役なのかってところです（ddqPCRは除く）

(無題) 削除/引用 No.4112-2 - 2015/05/21 (木) 07:56:36 - おお >[Re:1] たなかさんは書きました : 全体においてだいたい問題提起ができていると思われますので、それらについて落ち着いて考え直してください。細かく各論を書く時間がないので。一つくわえるとcDNAと合成DNAも違うといえば違いますよね。cDNAはRNAとの2重鎖になっている可能性がありますから。 > 最後に、メーカーが売ってるPrimer使っての�刧僂tだから、PCR効率の確認（80-120％以内入ってるとか）は必要ない、ってスタンスに皆さんはどう思われますか？ メーカーの推奨する酵素とかプロとコールを使う限り、一応よしと言うことでいいのではないでしょうか。もちろん絶対的かといわれるとそれはないので、ご自身の系で調べ点見るのはやれればこしたことがないでしょうけど。よくわからないですが80%って良しとしていい数字でしょうか。。。

qRT-PCRの検量線に合成DNAは使えるか？ 削除/引用 No.4112-1 - 2015/05/21 (木) 00:28:31 - たなか タイトル通りです。 そのような方が近くにおり指示されたので疑問に思い質問しました 今まで絶対定量は、「コピー数が分かる同条件の」サンプル入手が現実的に難しいイメージがあってなんとなく避け、検量線を引く比較定量法（希釈系列はサンプルcDNA）でしていました 現在、「合成会社に増幅配列のDNA合成させてそれを希釈してモル数（orコピー数）換算したら？」と言われているのですが、この場合どのような問題があるでしょうか？ �@そもそもcDNAではないという問題（そのPCR検量線はサンプルに使えない） �ART効率を完全無視するという問題 の他になにかありますか？ あと、 cDNAとlinerな合成DNAって、そんなにPCR効率変わるものでしょうか？ （それ以前に合成会社のpmol表示が個人的には信用出来ない気がするのですが） また、メーカーが売ってる標準RNAサンプルは、組織由来の夾雑物とか考えだすとRT効率・PCR効率がサンプルと同じ保証がない様に思うのですが、そこらへんは最近の酵素では誤差の範囲内なのでしょうか？ 最後に、メーカーが売ってるPrimer使っての�刧僂tだから、PCR効率の確認（80-120％以内入ってるとか）は必要ない、ってスタンスに皆さんはどう思われますか？ 沢山、質問してすいませんが、色々意見を聞きたく思います

全24件 ( 21 〜 24 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. /2

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---