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(無題) 削除/引用 No.4112-27 - 2015/06/01 (月) 11:27:25 - おお >[Re:26] たなかさんは書きました : > > これって、cDNAを希釈するやり方と同じく、他の色んな誤差をキャンセルするためにコントロール群との比で表す場合のみという気がしますけど、どうなんでしょうか？（Quantitiveと言われているけど、「絶対定量」って呼ばれるのには違和感がある。） 絶対定量をquantitativeとするひとと、絶対定量と相対定量をquantitativeとする人がいます。言葉の定義の問題かと思えます。semi-quantitativeは何倍とかいう関係は数字が怪しいけど、より量がおおければより強いシグナルが得られる場合とするひとがおおいとおもいます。 > リアルタイムPCR自体をどう使うかですが、うちは自前であって、手軽なので、なるべく少ない手間で、正確な値を出していきたいという姿勢です > ddPCRはお値段的に手が出ないです 議論が検量線に集中しましたが、最初からご指摘されていた、qPCRの系が違うだけで一桁以上の差が出るという指摘は本当はいい指摘で、何倍かというのがあまり重要ではない例を出したのですが、そうでない事もありますし、どの程度の変化なのかというのが、その先での判断を狂わすこともありえますので、注意しなければいけないと改めておもいました。まあ一つは検量線や、cDNAでのPCRの効率の確認ということで解決するのでしょうけどあらためて重要なことと再認識しました。 あとたなかさんの"うちは自前であって、手軽なので、なるべく少ない手間で、正確な値を出していきたい"というある意味こだわりがある姿勢は研究者としてわたしはいいことだと思っています。なのでそう言う人からの厳しい指摘はやはり耳を傾けるべきとも思ってます。 いまは何でもキットでそれをつかえばできるという錯覚みたいなものがあって、キットでなにか変なことが起こっても見抜けないとか、プラスミドのconstructionでも少し難しくなるととたんに成功しなくなったり、制限酵素などをつかった巧妙な方法も思いつかなかったり、思いついても何か間違えがあって成功しなかったりとか、もっと極端な例は、、、あ、このへんでやめときます。。。 ということで、こういう風にこだわりをもって将来もやっていってほしいなとおもいました。

(無題) 削除/引用 No.4112-26 - 2015/05/31 (日) 11:04:35 - たなか ＞cDNAにおいて、一度でいいからたとえば2倍に希釈してCt値がほぼ1ずれるかとか見ておいた方がいいよというsuggestionなら何の反論もなく合意いたします。 結局、ここですよね。 あと、結果に使用する測定値の最大と最小を少なくともカバーする範囲の希釈サンプルのCq値確認が必要なのかなと思います。2倍希釈で確保できる範囲はReferenceぐらいかなと 下の検量線のズレの話ですが、検量線がCq=Log(量)＋Y切片なので、わり算でキャンセルされますね。すいません 個人的には違和感がありましたが、PCRproductであれ、合成DNAであれ、Cq値が希釈の理論値と合うかのの確認をしておけば、測定の問題は解決できるという意見ですね つまり、実験外部からの理想的なスタンダードを導入する場合、サンプル内にPCR効率のズレさえなければOKで、例えばサンプルの100倍希釈と1000倍希釈と同時に測れば精度は保証できると（気になるならサンプルの希釈系列も作って測りたい範囲を一回確保すればいい） これって、cDNAを希釈するやり方と同じく、他の色んな誤差をキャンセルするためにコントロール群との比で表す場合のみという気がしますけど、どうなんでしょうか？（Quantitiveと言われているけど、「絶対定量」って呼ばれるのには違和感がある。） リアルタイムPCR自体をどう使うかですが、うちは自前であって、手軽なので、なるべく少ない手間で、正確な値を出していきたいという姿勢です ddPCRはお値段的に手が出ないです

(無題) 削除/引用 No.4112-24 - 2015/05/31 (日) 07:27:52 - おお えっとちなみに、cDNAにおいて、一度でいいからたとえば2倍に希釈してCt値がほぼ1ずれるかとか見ておいた方がいいよというsuggestionなら何の反論もなく合意いたします。

(無題) 削除/引用 No.4112-23 - 2015/05/31 (日) 07:08:13 - おお NUPDさん。そうですね切り出してそれをスタンダードにっていうのは昔やってたようですし、いまでもスタンダードがほしければやるかもしれませんね。 ただ質問者のなかでは合成DNAも精製PCR産物も、プラスミドも同じカテゴリーという意識でいるんじゃないかな。ここの議論のかなかでははたしも同じカテゴリーに入ると感じてます。 長い議論になってきてますので、フォローできない部分があったのではと察しますので、念のため。

(無題) 削除/引用 No.4112-22 - 2015/05/31 (日) 02:52:02 - NUPD 昔々のお話ですが、私が大学院生だったころ、 PCR productをアガロースで流して抽出して、 コピー数を計算して、それを希釈してスタンダードカーブを書いてました。 これだとそれぞれのプライマー効率(90%とか110%とか)を反映したまま 定量できて、その上コピー数で示すのですがいかがでしょうか。 同じサンプルで内部標準を示して補正すれば、 逆転写効率も同じ(はず)なのでより性格かなと。 抽出液に含まれるバッファーがどうとか言われるかもしれませんが。。。 時代遅れとのお言葉の直後に相当昔の話で恐縮です。。。(汗)

(無題) 削除/引用 No.4112-21 - 2015/05/30 (土) 10:55:04 - AP 思えば、バカ◯ョ◯カメラ並に普及しているreal-time PCRも、RNA-seqやらdigital PCRやらの台頭で時代遅れになりつつもあり。

(無題) 削除/引用 No.4112-20 - 2015/05/30 (土) 10:38:26 - おお 私はqPCRはよほどそれしか方法がない場合しかとりません。正確なデーターを得られるように改良が重ねられてきているでしょうけど、理詰めで説明されているほど実際の発現を反映しているのかという点で、見えないところが多いのでやはり不安になりますし、またその様にしっかりと実験系を作っていったとしても、系が働いているとみる(実際のサンプル内の量を確認するという意味で)のがそんなに容易でありませんから。 なのでデーターを見る目が違うのかもしれませんね。 もちろんかなりしっかりとした系があるということは否定しませんし、実際にあると思ってはいます。

(無題) 削除/引用 No.4112-19 - 2015/05/30 (土) 10:12:20 - AP ちゃんと全体を通して読んでいないのだけれど、 そこまでこだわるなら、古典的な（しかし今以て最もreliableな方法のひとつである）competitive PCRをしたらいいんじゃないかと思うんです。 realtime PCRは手軽に、そこそこ説得力があり、信じてもらえやすいデータが取れる方法だとは思いますが、突き詰めて考えるといろいろ難しい点があると思うんです。 私のところは自前の装置がないこともありますが、realtimeはざっと傾向を示すのには使っても、ここぞと言うときはcompetitive PCRで勝負します。 ちゃんとcompetitorとしてRNAをIVTで合成して、逆転写の段階からサンプルRNAに比率を変えて投入してね。

(無題) 削除/引用 No.4112-18 - 2015/05/30 (土) 07:31:39 - ほ 結局、「僕の中ではある程度意見が決まっているのですが」と言っていることや受け答えをみても、いくら議論しても平行線で終わるんじゃないかな。 単に同意してくれる人を捜しているように感じます。 どんな方法にも欠点はある訳だし、問題点がわかっていることは結果の真偽を見極めるのに大切ですが、あまり凝り固まった頭だと逆効果かなと。

(無題) 削除/引用 No.4112-17 - 2015/05/30 (土) 04:11:57 - おお http://www.gene-quantification.com/regier-frey-rel-quan-2010.pdf これのfigure 5なんかcDNAを希釈してCt値で量を見積もっても100倍希釈でほとんど理論値と変わらないし、彼らの計算方法で、cDNAで効率を 2.09 for ACT, 1.84 for EF1, 1.85 for UBQ, 1.81 for APX and 1.91 for SOD. と計算していますし、そんなに効率が悪いように見えませんけど、合成DNAでもこんなもんじゃないでしょうか。。。詳しい方コメントいただければうれしいです。

(無題) 削除/引用 No.4112-16 - 2015/05/30 (土) 03:24:56 - おお >本来はE^10/E^9＝10のものがE^10-E^9/3E^9-E^9＝5などになるためです。これがControl群。陽性対照群では本来はE^13/E^10＝E^3だとします。本来なら誘導倍率100。これが合成DNA検量線なのでE^13-8E^9/10E^9-8E^9=5E^3-4。誘導倍率1000です。 ここなんですけどね。RNAからcDNAへの変換効率、cDNAのテンプレートからdouble strand DNAへの変換効率、double strand DNAからのPCRの効率全部ごちゃ混ぜになってませんか? cDNAで純粋にdouble strand DNAからのPCRの効率を計算すると皆さんどれくらいの効率になりますでしょうか? あとCt値では引き算ですけどE^13(たぶんEは2の方が見ごごちがいいと思いますが)と、linearな関係に直しているんだから引き算じゃなくって割り算しないといけないじゃないですか?両方同じもので割るんだから相殺されますよね。

(無題) 削除/引用 No.4112-14 - 2015/05/29 (金) 23:07:55 - おお >一方で、伝統的に行われてきたcDNA希釈検量線を否定する派閥もあるそうで、なんだか個人的には？です。 否定はしてませんよ。長所短所があるだろうという話です。わたしは合成DNAでも、cDNAの希釈系列でもどちらでもいいと思います。もちろん目的によっても使い分けるべき実験はあるでしょうけど。cDNAの場合は一つの実験内の比較はいいけど、reference cDNAを常に持っておかないと毎回の比較がやりにくくないですか?

(無題) 削除/引用 No.4112-13 - 2015/05/29 (金) 21:06:47 - F 横から失礼します。 論点はずれてしまうかもしれませんが、多くの場合、qPCRの結果だけで、生物学的解釈をするわけではないと思います。（だからといってあまりにいい加減な基準でデータを示すのを許容するわけではありません。） >『精度は自分の実験の許容範囲ないで自身で決めるものでもあります。』 私個人的にはおおさんのおっしゃられたこれに尽きると思います。

(無題) 削除/引用 No.4112-12 - 2015/05/29 (金) 20:16:49 - たなか 実験系（目的）によって、倍数の正確な値が必要ではないこともある部分は異論ありません。 その上で少し話を主題に戻したいと思います。 前提として「倍数の正確な値を知りたい」として合成DNAは検量線として適切か？です おおさんの意見では沢山ある論文の殆ど全てが間違っているとは受け入れがたいという意見です。 しかし、それは印象論で、推定の域をでません。 実際にMIQEガイドライン（国際的なリアルタイムPCRガイドライン）が主張しているのは、殆どの論文に再現性或いは再現性に必要な情報を欠いているということです また、AAさん、おおさんが伴に私の「現状、cDNA検量線が最もまともなサンプルの適切な測り方ではないか？」という意見に対し疑念を呈されるのは、 「ｃDNA希釈系列ではPCR効率に影響を及ぼす夾雑物が希釈されている」という事実です。 しかし、Probe法を用いる場合、cDNA希釈系列を検量線として、E^6の範囲でR^2値が0.9995を下回ることは稀です。つまり夾雑物希釈の影響によるPCR効率の変化（＝検量線の歪み）はまず観測されません。その中に希釈したサンプルｃDNAのCq値が収まるとすれば、それほど大きな誤差が生じることは数学的に棄却されます。（もっと言えば例えば100倍希釈サンプルと1000倍希釈サンプルを測定し、結果がほぼ同じであることを示せば完璧です） 一方で、同時に同サンプルを合成DNA希釈系列で測定すると、検量線と＜真の検量線＞の間のズレのために結果に大きなズレが生じます。これは合成DNAがPCRに有利であるために、サンプル中のTarget/Referenceともにとても小さく見積もってしまい、本来はE^10/E^9＝10のものがE^10-E^9/3E^9-E^9＝5などになるためです。これがControl群。陽性対照群では本来はE^13/E^10＝E^3だとします。本来なら誘導倍率100。これが合成DNA検量線なのでE^13-8E^9/10E^9-8E^9=5E^3-4。誘導倍率1000です。 このように理想的なPCRだったと仮定して計算しても、100倍の誘導倍率のものさえきちんと評価できず10倍のズレを生じています。これはサンプル中のｃDNA量のずれに合わせて起こるため、個体差のズレが見かけ上過大評価されたり、過小評価されたりします。このような検量線を積極的に採用する理由が私は？です 合成DNAを検量線にして、PCR実験条件をあたかも綺麗だったかのように示しても、サンプルの実際は反映されていません。また、それを込みで悪いことを考えてやれば、本来は個体差が大きく有意差のないTargetに有意差を付けるのは容易です。（それこそReferenceのCq値をTargetから外したとこに設定して論文にCq値載せなきゃいいです） つまり、「特定のPCR条件下における増幅効率や直線性を担保するだけなら充分」で 生物学的解釈をするには不十分なのではないか？と思っています 一方で、伝統的に行われてきたcDNA希釈検量線を否定する派閥もあるそうで、なんだか個人的には？です。夾雑物が薄まりPCR効率にズレが生じるという疑念を抱くのなら、上記のようにそうではない堅牢性をもつPCRであることを直線性とR^2などから示せばいいだけでは？と思います。 一方合成DNAを検量線とする場合、サンプルの測定結果を担保する手段が分かりかねます

(無題) 削除/引用 No.4112-11 - 2015/05/29 (金) 15:48:08 - おお >>それから、Biologyの実験で3000倍と300倍の違いで考察が変わることはないと書いていますが本当にそうでしょうか？ >たとえばx線フィルムをつかうと実際のシグナルと直線的な関係にあるのは10倍の範囲内です。なので定量的な実験にはかなり無理があります。 >もちろんコピー数が重要な場合もありますし300倍と3000倍で違った解釈をしないといけない場合もありますので全ての場合において考察に影響しないといっているわけではありません。 考察が変わる可能性がある具体例を書いたのでそうでない例をあげます。 たとえばある転写因子が遺伝子Aの発現を制御しているというworking hypothesis立てたとします。これを証明するためにその転写因子をKDして、遺伝子の発現をqPCRで調べたとします。コントロールに比べてKDで五倍下がっていても五十倍下がっていて、working hypothesisをサポートしているデーターとして使うでしょう。転写因子がその遺伝子を制御しているということに付随する考察はまず変わらないと思います。

(無題) 削除/引用 No.4112-9 - 2015/05/29 (金) 15:32:35 - AA 疑問に思ったのですが、 合成DNAはcDNAと違って標的以外の配列を含まない、という点をもって スタンダードとして不適と言うのはちょっと極端ではないでしょうか？ おおさんの指摘のように 希釈した時点で夾雑するtotal RNA配列の絶対量は変化しますし、 サンプルとサンプルの間には夾雑物や 標的遺伝子以外のcDNAの量にも差があるはずですから 正確な条件はサンプルごとに異なる事になり、 サンプル間では比較できないことにならないでしょうか？ 私は標的配列を含むプラスミドを作製し、 コピー数を計算してスタンダードにすることもしておりますが、 特定のPCR条件下における増幅効率や直線性を担保するだけなら 十分だと考えています。

(無題) 削除/引用 No.4112-8 - 2015/05/28 (木) 22:18:46 - おお >それは「サンプルの真の検量線」ではないと言っているのです。 >逆に合成DNAを検量線にして何を図るのですか？ でもELISAはlysatesに標準物質を混ぜたりしません。液クロなどもそうですし、蛍光物質などもそうだと思います。 なので合成DNAでの検量線はそんなに変なやり方だと思えません。cDNAも希釈すると夾雑物の量が変わるわけだから、どちらにしても長所、短所があるということじゃないでしょうか。もし発現が一番高いサンプルと低いサンプルでいろいろな比でまぜてやればよりいでしょうけど、ターゲットの増幅率に影響与えそうな配列をもっている遺伝子の発現量も違うかもしれませんよ。 もちろんプラクティカルな状況でどの程度系が正確かどうかはなにがしかのサポートできるデーターがあった方がいいこともあるかとおもいます。いずれにしろ半定量性が保証されていればたいていの論文ではたいてい差ほど変なことをやっているとは思えないです。 ただコピー数を慎重に見積もらないといけない場合にはnegativeなRNAに合成RNAを加えたりしてうまく働いているかどうかやっているんじゃないかと思いますけど。 >それから、Biologyの実験で3000倍と300倍の違いで考察が変わることはないと書いていますが本当にそうでしょうか？ それはほかの方の意見も聞くことにしましょう。たとえばx線フィルムをつかうと実際のシグナルと直線的な関係にあるのは10倍の範囲内です。なので定量的な実験にはかなり無理があります。で何を見るかというと半定量的な判断です(もちろん半定量のためにsignal intensityを測ることはあります)。こういう場合は300倍でも3000倍でも数字を導くことは困難です。PCRだけでは信用できないからノーザンブロットをしろといわれる時代がありました。そのノーザンブロットでフィルムでやいた結果得られるのがこんな状況なんですよ。 もちろんコピー数が重要な場合もありますし300倍と3000倍で違った解釈をしないといけない場合もありますので全ての場合において考察に影響しないといっているわけではありません。感染ウイルスの量とかなら、病態の状況とか他の個体への感染性などの判断にもつながってくるかもしれませんので正確なほどいいでしょうね。 有意差の議論は統計的手法によるところがありますので、差を出すことができるかどうかは別の議論だと思います。 合成DNAを使うことによる実験的な短所とかご指摘のことは理解していますし、そう言う意味で間違っているというつもりはございません。

(無題) 削除/引用 No.4112-7 - 2015/05/28 (木) 19:09:03 - たなか >>サンプルの真の検量線）に対し、合成DNA検量線は下にズレるので、 > その過小評価の＜差分・引き算＞は同じように＜引き算＞された標準遺伝子で＜割り算＞しても計算上補正されずズレにしかならないと思うのです。 > おおさんは「標準遺伝子比率補正＞＞検量線補正」の意見ってことでしょうか？ >いみがわかりません 合成DNAはtRNAを逆転写したものでもなく、正に標的配列しか含んでいないわけですからPCRに圧倒的に有利です。純粋なそのPCR実験条件でのPCR効率が出るでしょう （そうやって簡単に綺麗なPCR効率を取ってくるって意見の人見たことあります。論文書くには有利でしょうね） それは「サンプルの真の検量線」ではないと言っているのです。 PCRの実験をしているわけではなく生物学の実験をやっているのですから、 使用している試薬の精度をチェックしたところで、ソレがサンプルに外挿不可であれば意味がありません。 逆転写効率は最近はそれほど大きく動くことがないので、ちょっとチェックすればすぐに定常範囲が取れます。問題はサンプルが結局tRNAであり多様のRNAとcDNAを含むこと。 それこそ、「そもそも1回サイクル回せばcDNAも合成DNAと同じ」ということにはなりません。 おおさんの言ってる意味がまったく分かりません。 逆に合成DNAを検量線にして何を図るのですか？ 希釈倍率が幾つだったか忘れてしまった合成DNAの濃度を測定するのには使えるかと思います。 全体的に見た時の実験条件をなるべく揃えた条件ではないのでは？と思います 検量線が真から遠い状態での測定結果に更に「リファレンス補正」をかける行為は計算の順番から言っても、誤差の増加を意味するのに「結局リファレンスで補正するから」「結局コントロール群との比率で見るから」大丈夫ってそれどうなんでしょうか？ それから、Biologyの実験で3000倍と300倍の違いで考察が変わることはないと書いていますが本当にそうでしょうか？ �刧僂t法であれば、不正確であるが故に30分の1に低下しているものを100倍に見誤ることもありますし、有意差がないところに有意差を付けることもできます。そういうものはProbe法できちんと実験条件を揃えて測った時にすぐに分かります。せめて＋とーを見誤ってないことの証明としてCq値載せろよって話なんですけど、載せてない論文も多くて、MIQEなんてあるんじゃないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4112-6 - 2015/05/26 (火) 02:41:36 - おお >[Re:5] たなかさんは書きました : > ご意見ありがとうございます > > ＞希釈も全体の核酸濃度などが変わるから性格にいうと同じ条件でサンプルと比べてませんよね。 > > ここですが、だいたいの場合、cDNAを使ったスタンダードカーブ法で行う人はサンプルを検量線の真ん中付近に来るように希釈しているので、その広いダイナミックレンジの中ではその濃度誤差は殆ど無視できると思います > もちろんそのために検量線も見ているわけですし、ソレで補正しているので、結果にはその誤差は持ち込まれないわけですよね たとえば希釈したことにより、PCRの効率が変わったとしたら、2倍に希釈したスタンダードとおなじCt値がでる希釈してないサンプルではCt値が同じとはいえRCRチューブ内に同じコピー数のターゲットが入っていたといえないですよね。 > > �刧僂t法を行ってる人は多くの場合そのダイナミックレンジも検量線も確認していないわけじゃないですか（先にあげた市販Primerの間違った信頼の仕方など）。そこで更にダイナミックレンジが狭いSYBR法ってなるとなんだかなぁってあくまで個人的な印象です それは偏見かもしれませんよ。レンジとかあらかじめ基礎データーをそろえているかもしれません。 > > 例え同じ半定量でも、同じ手間でより正確な（少なくとも合成DNAを絶対定量の検量線と仮定するよりは）結果を出せるスタンダードカーブ法があることを考えると、 > そういう同じ手間で正確性の低い�刧僂t法をわざわざやってる論文は（僕は個人的にはそこを一つの目安にして）そういう論文なんだと考えますね。 半定量は量があるものに加えて多いか少ないかという情報を与えているだけで、何倍などの数値にあまり意味がありません。またbiologyで発現が30倍上がったというデーターと300倍上がったというデーターで数値が結論に影響を与えるかというと、そうともいえないことも多いと思います。 要するに小数点一桁の精度で十分なのに小数点5桁まで精確に出す作業をやるのにどれくらい意味があるのかという議論と同じです。なので一概にそれがだめだというのはいえないのではないかと思います。 > すいません。合成DNAが使えるか？の話に戻します。 > > 相対定量で、という前提で > それでも検量線には「合成DNAよりcDNAがいい」と僕が思っているのは、 > 合成DNA希釈液とサンプルからのRNA抽出由来cDNAでは、RNAとの結合、夾雑物の存在、pHなど、あまりに条件が違うからです（合成DNAの法が大幅に有利で本当は同じ濃度でも立ち上がりが早くなる） pHはあわせればいいじゃないですか。。。そんな莫大な量が入っているわけでもないので、バッファーの効果でコントロールできますよ。 cDNAは最初のサイクルでDNAのdouble strandができてしまえば合成したDNAと変わらないじゃないですか。cDNAの夾雑物というのはデメリットを最初の方に書きました。 > （サンプルの真の検量線）に対し、合成DNA検量線は下にズレるので、 > その過小評価の＜差分・引き算＞は同じように＜引き算＞された標準遺伝子で＜割り算＞しても計算上補正されずズレにしかならないと思うのです。 > おおさんは「標準遺伝子比率補正＞＞検量線補正」の意見ってことでしょうか？ いみがわかりません

(無題) 削除/引用 No.4112-5 - 2015/05/25 (月) 23:39:50 - たなか ご意見ありがとうございます ＞希釈も全体の核酸濃度などが変わるから性格にいうと同じ条件でサンプルと比べてませんよね。 ここですが、だいたいの場合、cDNAを使ったスタンダードカーブ法で行う人はサンプルを検量線の真ん中付近に来るように希釈しているので、その広いダイナミックレンジの中ではその濃度誤差は殆ど無視できると思います もちろんそのために検量線も見ているわけですし、ソレで補正しているので、結果にはその誤差は持ち込まれないわけですよね �刧僂t法を行ってる人は多くの場合そのダイナミックレンジも検量線も確認していないわけじゃないですか（先にあげた市販Primerの間違った信頼の仕方など）。そこで更にダイナミックレンジが狭いSYBR法ってなるとなんだかなぁってあくまで個人的な印象です 例え同じ半定量でも、同じ手間でより正確な（少なくとも合成DNAを絶対定量の検量線と仮定するよりは）結果を出せるスタンダードカーブ法があることを考えると、 そういう同じ手間で正確性の低い�刧僂t法をわざわざやってる論文は（僕は個人的にはそこを一つの目安にして）そういう論文なんだと考えますね。 「検量線を引かない解析法」という触れ込みが独り歩きしてpcr効率を確認する必要もないと勘違いしている人がけっこういるのが現状なんだろうなと思います。 すいません。合成DNAが使えるか？の話に戻します。 相対定量で、という前提で それでも検量線には「合成DNAよりcDNAがいい」と僕が思っているのは、 合成DNA希釈液とサンプルからのRNA抽出由来cDNAでは、RNAとの結合、夾雑物の存在、pHなど、あまりに条件が違うからです（合成DNAの法が大幅に有利で本当は同じ濃度でも立ち上がりが早くなる） 「結局、比率にするから大丈夫じゃん」って意見に対して思うのは （サンプルの真の検量線）に対し、合成DNA検量線は下にズレるので、 その過小評価の＜差分・引き算＞は同じように＜引き算＞された標準遺伝子で＜割り算＞しても計算上補正されずズレにしかならないと思うのです。 結果・信頼性に影響を与える順に「検量線の正確性・補正＞＞標準遺伝子比率補正＞＞ラン間のバリデ」と思うんですが、 相対定量なら合成DNAでもいい。というのは おおさんは「標準遺伝子比率補正＞＞検量線補正」の意見ってことでしょうか？ っていうのは昔実際に比べてみて大きく結果が違ったことから考えたことなんですけど（でもその頃はカラム抽出じゃなく夾雑物が多いTRIzolでした）。最近の酵素とかだと効率が高いので、そこまで差が出ないんですかねー？

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