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(無題) 削除/引用 No.4106-20 - 2015/05/20 (水) 13:44:08 - サンショウウオ >>AP様　 　目的のGPCRを発現している細胞のKO株を作ればネガコンにはなり、リガンドに対する応答の差異をみれば候補にはなると思います。ただ、あくまで間接的な観察なので、対象外のGPCRに作用していないかが心配です。 　ポジコンを探しに行くようなテーマなので、ポジコンがないのは当然ではありますが。 >>mon 様 下流シグナルでの検出系で区別が付くか判断するために、同一経路を活性化する既知リガンド、GPCRで試してみるのは有りかもしれません。　少し文献を探してみます。 CFP-GPCRと下流側タンパク質-YFPのFRETで直接検出しようとしたこともあるのですが、先行研究でシグナル応答がかなり弱くなることがわかっていたので、難しいかなと思っています。やはりGFPはでかいらしい。 >>中年様 　理想的なポジコンが無いのはやはりしかたがないようですね。 　化合物ライブラリをまぜてそれで応答が見られるかどうかをみるのは考えていませんでした。一次スクリーニングのまえにそれをやるのは面白そうです（０次スクリーニング？）。（私が何か誤解していないか心配ですが） >>りが様 　　細胞のライセート、FBS、培養上清などを過剰発現株にかけてみて、応答が見られるかでも検索は可能だと思います。が、一応、、、、他機関から提供されたライブラリを使うという目的もあって、FBSを分画→各ピークをかけて応答を見る→構造同定といったことがやりづらいです。（あと、分子構造同定は苦手分野だったりします。） >>おお様 　なかなか難しい仕事をされていたようで。ポジコンない状態でやることはあるのですね。 　文献がまだ調べきれていないので、下流シグナルが同一且つアゴニストが既知のGPCRがあれば、それを使ってみたいです。安全策をとるならやはりポジコンがあったほうがいいのは 　うまくいくときはうまくいく（可能性がある）系なので（机上の空論に近いものですが）、進めてみます。 　下流シグナルの応答とGPCRのリガンド依存的構造変化の両方が同時に観察できれば他の受容体で活性化された可能性を排除できると思いますが、生細胞ではなかなかむずかしそうですね。。。。

(無題) 削除/引用 No.4106-18 - 2015/05/19 (火) 13:41:39 - おお なにかクルードな状態でそこにライガンドがふくまれているだろうという溶液とかあれば、それをかけるだけでポジコンになりそうですが、そう言うのではないのですよね? ライガンド依存の構造変化を検出するなら(FRETとか)、配列が似た既知のリセプターとそのリガンドで構造変化を検出できるかを確認するというポジこんならそれでもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4106-17 - 2015/05/19 (火) 13:35:59 - おお あ、電位はかんけいないのね。。。まあ同じ作用をもたらす系ということで。。。

(無題) 削除/引用 No.4106-16 - 2015/05/19 (火) 13:21:46 - りが 下流シグナルの活性化を検出する系ができているなら、取り敢えず手に入るもの数種類で試してみる？ FBS有り無しとかで差が見られたり？とかはないでしょうか

(無題) 削除/引用 No.4106-15 - 2015/05/19 (火) 10:05:58 - おお >[Re:14] 中年さんは書きました : > そうは言っても、オーファン受容体に対する新規リガンドのスクリーニングは、そういう状況（厳密な意味でのポジコンが得られない）からスタートするしかないわけですし（アゴニストとして作用するモノクロ抗体があるなどの場合は別として）、過去の成功例でも状況は大して変わらないと思いますよ。実験にはポジとネガのコントロールが必要というのは理想的にはその通りですが、こういうモノ取り実験の場合は必ずしもそれがかなえられるとは限りませんよね。 私もそう思います。ポジコンがない状態でスクリーニングというのを(リセプター、リガンドというものではないですが)したことがあります。 まあhigh throughput screeningの施設のひとは、まずはポジコンでどのくらいの差がありそれくらいのばらつきがあるかをみて、スクリーニングが可能な系かどうか示せといいますが、ないのにどうしろというのかというといやあった方がいいしと、、、で遺伝子を発現させてその毒性をレスキューもののスクリーニングだったのですが、その遺伝子の発現自体をブロックさせるものをコントロールに使いました。それでもやはり施設の人はこれは理想的じゃないんだけどなと、、、不満げでした。 まあすくなくともちがうリセプターのリガンドを使うにしても、下流がシェアされてなければ何を見ているのかわからないですね。ポジコンの目的はまずは系が働くかをみるということですから、そのリセプターが活性化されたことで起こる現象があなたの検出系で確実にdetectできるのかというのを見るためのものとして考えればいいのかと思います。 ちょっと詳しくはわかりませんがほかのリセプター、リガンドの組み合わせて、同じイオンの流出(流入)がおこり、それを検出系に使おうというのであれば違うその違うリセプター、リガンドの組み合わせでもポジコンとしては成り立つでしょう。 APさんの指摘のようにKOなどの株を作成してネガティブなコントロールをとるほうがシステムとしてはすっきりします。ただし違うリセプターがおなじリガンドをシェアしてないかという不安要素はあります。 なんだか時間がはいている隙間に書いたので、、、統率が取れてるかな、、、

(無題) 削除/引用 No.4106-14 - 2015/05/19 (火) 08:20:14 - 中年 そうは言っても、オーファン受容体に対する新規リガンドのスクリーニングは、そういう状況（厳密な意味でのポジコンが得られない）からスタートするしかないわけですし（アゴニストとして作用するモノクロ抗体があるなどの場合は別として）、過去の成功例でも状況は大して変わらないと思いますよ。実験にはポジとネガのコントロールが必要というのは理想的にはその通りですが、こういうモノ取り実験の場合は必ずしもそれがかなえられるとは限りませんよね。 まずは、リガンドを含む可能性のあるクルードな画分でシグナルが確認されるかどうかを見てみて、それで有望そうなら先へ進むというのが現実的ではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4106-13 - 2015/05/19 (火) 05:48:48 - mon リガンドをHTPで検索するため「下流シグナルの活性化」をいかに簡便に行うかがミソだと思うけど。GFP、luciferase、FRETなどで測定できるようにするとか。 で、その系が問題無く働くか否かの検証において、使用（測定）する「下流シグナル」の一つが既知のGPCRと共通であるなら、既知リガンド・GPCRがポジコンとなりますね。 ...と同僚の方は考えているのでは？ さらにAPさんの提案のようにKO株もあるとスクリーニングの精度が上がりますね。

(無題) 削除/引用 No.4106-12 - 2015/05/19 (火) 01:21:53 - AP 当該GPCRを潰した株を作って、親株では下流シグナルが動くけど、潰した株では動かない物質を探すんでいいんじゃなかろうか。こういうケースでポジコンはどれ程、必要とされるだろうか？ >アゴニストが既知の受容体に変更したほうがいいと指摘されました。（とはいわれたものの、リガンド既知の受容体をやる意味があるかどうか。。。。。） 医薬品開発で、リード化合物を探すようなケースではありそうな話ではあります。

訂正 削除/引用 No.4106-11 - 2015/05/19 (火) 01:09:49 - サンショウウオ No.4106-9 の投稿は ＞＞おお様 　宛のものです。 　お詫び申し上げます

。。。。となると。。。。。 削除/引用 No.4106-10 - 2015/05/19 (火) 01:08:28 - サンショウウオ 　皆様にご意見いただき、色々と見落としていたところに気づけました。 　まずは、練習のために、アゴニストが既知の受容体を使って応答を見てみようかなと。。。。もおもう。。。。。けど。。。やっぱりよくわからない。 　既知のアゴニストと受容体の応答をみるなら、新しいスクリーニング方法を考えるぐらいしたほうがいいかななんて思ったりも。 　ひとまず、、、、もう一回テーマを考えなおしてみたいと思います。（考えたテーマが地雷と化しているような気がしてきました）

お返事ありがとうございます 削除/引用 No.4106-9 - 2015/05/19 (火) 01:03:27 - サンショウウオ 　イオンチャネルと膜電位応答性のGPCR（だった気がする）を融合して機能を拡張した例もあったと思います。 　ただ、GPCRの構造変化の仕方を考えると、適切に 　　リガンドや電位などのシグナル受容→後付の構造変化→目的GPCRの変化→下流シグナル活性　 と伝達するための候補が思いつかないです。。。。。 　常時活性化する変異を入れた受容体をTetでやると、多分誘導してから十分に発現するまでに数時間はかかるのではないかと（大腸菌並みの感想）思いますが、一般的なGPCRのリガンド受容→活性化と比べてアゴニスト代わりにするのはムリがあるような気がします。

お返事ありがとうございます 削除/引用 No.4106-8 - 2015/05/19 (火) 00:56:55 - サンショウウオ ＞＞cDNA様 　対象としている受容体の下流にあるシグナル経路は、現在1つはわかっているのですが、その他の経路に関わっている可能性は排除できていません。 　また、スクリーニング時に、小分子が予期せぬ内在性の受容体を活性化した場合も区別できないのではないかと懸念しています。

お返事ありがとうございます 削除/引用 No.4106-7 - 2015/05/19 (火) 00:49:05 - サンショウウオ ＞＞deE様 　「リガンドスクリーニング時には、受容体が変性していないことを担保する」 　この点を考慮すると確かに変異体ではリガンドとの相互作用をすっ飛ばしてシグナルを増強するので、今回のポジコンにはなりそうもないですね。

お返事ありがとうございます 削除/引用 No.4106-6 - 2015/05/19 (火) 00:44:34 - サンショウウオ ＞＞中年様 　アゴニストが未知なので、ポジコンとして変異体を作ろうと思ったのもあるのですが、どの程度の強さで下流シグナルが活性化されればいいのか指標を知りたいというのもあったので変異体を使えないかなと考えていました。 　やはり、スクリーニング時のポジコンには使えなさそうですね。

(無題) 削除/引用 No.4106-5 - 2015/05/18 (月) 23:13:37 - おお やはりアゴニストを加えて期待する変化が起こるというポジコンをもってたほうがいいということかと思いました。その受容体、何か既知のアゴニストをもつものとキメラにして、そのアゴニストでONにできるようにはなりませんかね。 あとは常時活性化しているのと、アゴニストONで活性化した初動は違うかもしれません。 その変異体、tetで誘導されるシステムで導入してtetがあたかもアゴニストの様に働くっていうのは、、、だめかな。。。

(無題) 削除/引用 No.4106-4 - 2015/05/18 (月) 23:11:21 - cDNA どんな実験なのか何の為のポジコンなのか、なかなか理解出来ずにいたのですが、標的の受容体とその下流のシグナル系がつながっていることを示したいポジコンという理解でいいでしょうか？ 合っているとすれば、変異体は意味がありそうですね。 でも、その細胞群を二つに分けても、目的のスクリーニングには使えないので、ポジコンとしての意味は薄いとも言えます。 リガンドが分かっている受容体は上記の下流のシグナル系につながることが分かっているのでしょうか？ 全く別のシグナル系につながっていたり、ほぼ単独で観察できるものなら、ポジコンとしての意味が分かりにくいですが、変異体と違って、複数に分けた細胞群を無処理とポジコンとスクリーニングに割り振ることが出来る点で、細胞が健全であることのポジコンにはなりそうです。 同じシグナル系につながっているなら、ベストと言わないまでも良いポジコンだと思います。

(無題) 削除/引用 No.4106-3 - 2015/05/18 (月) 22:50:49 - deE リガンドスクリーニングのポジコンということなので、一連のスクリーニング操作中にその受容体が活性を保持している(変性していない、リガンド結合能がある)ことを担保するためのポジコンという意味ではないですか？ そういう意味においては、変異受容体は「リガンドスクリーニング実験の」ポジコンにはならないし、やはり既知アゴニストがポジコンとして適切かなと思います。

(無題) 削除/引用 No.4106-2 - 2015/05/18 (月) 21:16:34 - 中年 「何に関して」のポジティブコントロールと考えているかによりけりでは。 シグナルの検出手段や実験装置のセッティングという意味では十分ポジコンになっていると思いますが、そのポジコンが動いたからといってスクリーニングが機能するとは限りませんよね。変異体を導入した細胞をスクリーニングに使うわけではありませんから。

リガンドスクリーニングのポジコンについて 削除/引用 No.4106-1 - 2015/05/18 (月) 17:13:27 - サンショウウオ 　いつも勉強させていただいてます。 　新年度、、、ということで新しいテーマを考えた結果おかしなことになってしまった感がありまして、、、GPCR関係です。 　アゴニストが未知の受容体のリガンドスクリーニングを、下流シグナルの活性化をもとにしてスクリーニングしようと考えているのですが、そのポジコンをどうしようか迷っています。 　受容体側は先行研究で特定のアミノ酸に変異を入れると活性化されたままになることがわかっているので、それを発現させた細胞のシグナル活性を測定すれば、アゴニストによって活性化されたシグナルを計測していることと同じなのではないかと考え、ポジコンに使えるのではないかと考えています。 　が、、、、、、同僚に相談したところ、常時活性化している変異型受容体はポジコンにならず、既知のアゴニストしかポジコンにはならない。アゴニストが既知の受容体に変更したほうがいいと指摘されました。（とはいわれたものの、リガンド既知の受容体をやる意味があるかどうか。。。。。） 　アゴニストが未知の受容体のスクリーニングをする時のポジティブコントロールに、常時活性化する変異型受容体を用いるのは論理的に問題があるのでしょうか。 　浅学稚拙な質問で申し訳ありませんが、ご教授いただければ幸いに存じます。

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