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(無題) 削除/引用 No.4094-3 - 2015/05/14 (木) 18:33:49 - ats Zeocin添加培地では定常期の菌体密度がやや低いことがあります（頻度は多い気もする）が、TB培地で得られるplasmid量はそんなに悪くないですよ。 1.塩濃度が濃いとZeocinが析出することがある(Zeocinが効かない）だけで、増殖が遅いのはそのplasmid固有の性質だと思います（耐性遺伝子の発現が弱い、複製が遅いなど）。 2.pHはZeocinの安定性に関与するので、freshに加えている分にはplasmid収量には影響ないと思います。 なお、私はTB培地に関してはpHを調整しませんが、粉を混ぜただけのLB培地はやや酸性なので、Low-Salt (5g/L NaCl)でZeocinを使うときには1M NaOHを1mL~2mL/L加えています。市販の調合済み粉末のSOB培地を使うときもあります。

(無題) 削除/引用 No.4094-2 - 2015/05/14 (木) 18:22:27 - AP pHがはずれると「効かなくなる」んですよね。 「効かなくなる→殖えやすくなる」はずですが、現状は「殖えにくくなる」のが問題でしょう？　だから、ポイントはpHとかZeocinの力価の低下では無いと思うんです。 プレート培養でしっかりZeocinをかけてクローニングしたら、それを液体培養するときは、適当な濃度まで下げるとかすればいいんじゃなかろうか。

Zeocineを用いた大腸菌培養について 削除/引用 No.4094-1 - 2015/05/14 (木) 16:15:05 - Zeocine Zeocine（100 mg/ml）を購入して、実験を進めていますが、大腸菌のカルチャーで、増殖不良の事態に陥っています。 ゼオシンは、通常のLB プレートも、大腸菌の培地も、終濃度 25 μg/ml になるよう調整しました（1Lの培地に 250 μl 添加）。 LB プレートの時には、コロニーが多数でき、インサートの確認（ほぼ100%）もできたんですが、コロニーが増殖する時間が、アンピシリン（他のベクター）の時と比べて、かなり遅い印象を受けました。 その当たりのコロニーを液体培地に入れて、24 時間カルチャーしても、増殖不良でした。この際、栄養リッチな培地（LB ではありません）を使いました。 その１Ｌ中の内訳は、 Ａ Trypton 12g, yeat extract 24g, glycerol 4ml ⇒ 900 ml Ｂ KH2Po4 2.31g（0.17 M）, K2HPO4 13.5g（0.72 M） ⇒ 100 ml それぞれ、別々に滅菌した後に、混合して、温度が下がった時点で、ゼオシンを添加。 先ほど、説明添付書を見ましたところ、ゼオシンは、pHに sensitive と書かれてありました。しかも、Low Salt LB agar medium（1L 中に、yeat extract 5g, Tryptone 10g, NaCl 5g, Agar 15g, pH 7.5）を使用することと書かれてありました。 つきましては、質問が２つございます。 １．やはり、通常の LB 培地（1L 中に、yeat extract 5g, Tryptone 10g, NaCl 10g, Agar 20g, pH 7.0）では、増殖不良なんでしょうか？ ２．液体培地の pH 7.5 は、厳密でないといけないでしょうか？ 以上、よろしくお願いいたします。

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