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CRISPR/Cas9でKnock outした細胞のコントロールについて トピック削除
No.4091-TOPIC - 2015/05/13 (水) 15:21:44 - OSK
初めてトピックを立てさせていただきました。宜しくお願いします。

Crisper/Cas9　システムを使用し、Huh7.5細胞という肝癌cell　lineのある分子をノックアウトした細胞を作製しました。その細胞とPBMCなどを共培養して免疫能を評価したいのですが、コントロールの細胞はどのような細胞になるでしょうか。

純粋にHuh7.5細胞とPBMCでの共培養群がコントロールになるのか
それとも
Huh7.5細胞にCrisper/Cas9でプラスミド？だけtransfectionした細胞＋PBMCで共培養した群がコントロールになるのか？

SiRNAによるノックダウンのときはSi controlといったものがあると思いますが、Crisper/Cas9によるノックアウトの際もSi controlに相当するものは作製できるのでしょうか。

Crisper/Cas9について十分理解できていないのが原因かと考えておりますが、ご教授のほどよろしくお願いいたします。
　
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(無題) 削除/引用
No.4091-7 - 2015/05/13 (水) 21:12:07 - AP
では、
>クローニングしたラインの中でハズレの（ノックアウトされていなかった）細胞株をコントロールにする
というのはreliableではないでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.4091-6 - 2015/05/13 (水) 20:23:17 - おお
なんとなく、guideRNAをデザインしてない空ベクターをいれたコントロールをとる方がすっきりするなという印象です。

(無題) 削除/引用
No.4091-5 - 2015/05/13 (水) 20:13:03 - OSK
APさん
>クローニングしているのでしょうか。だとしたら、複数のラインを確立しているのでしょうか。クローニングした中にノックアウトされていないラインがあったりしますか

ありがとうございます。single　cellをとってきて、クローニング、複数のラインを確立し、遺伝子がmRNAレベル・蛋白レベルで落ちていることをました。

独り言さん・おおさん
ご指摘いただきありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.4091-4 - 2015/05/13 (水) 20:04:55 - おお
レンチなどを使っていたら、細胞内に遺伝子が残っているだろうしそういうばあいはCas9の発現に対する免疫的な反応が気になりますね。
その場合は正常のものをプラスミドで発現させたものをコントロールとするのもアイデアですが、そのプラスミド配列もターゲットになるよなぁ。。。

(無題) 削除/引用
No.4091-3 - 2015/05/13 (水) 19:00:33 - 独り言
CrisprのKO細胞株だと、クローン株の違いとCrisprのoff target効果を心配する必要があるので、
一番よいコントロールはKOした株にKOした遺伝子を発現（トランスフェクションやインフェクションなどにより）させたレスキュー株でしょう。

(無題) 削除/引用
No.4091-2 - 2015/05/13 (水) 17:32:58 - AP
>Crisper/Cas9　システムを使用し、Huh7.5細胞という肝癌cell　lineのある分子をノックアウトした細胞を作製しました。

クローニングしているのでしょうか。だとしたら、複数のラインを確立しているのでしょうか。クローニングした中にノックアウトされていないラインがあったりしますか。

→ノックアウトに関係ない特殊な性質の細胞のクローンだったりする可能性があるので、複数のノックアウトラインで現象を検討する必要がある。
ノックアウト〜クローニングを経ることで、親株をmassで見たときと異なるが、標的遺伝子とは関係のない性質が固定されたラインが出来る可能性がある。単純に親株をコントロールにするというのもよくある話だけど、上記の懸念から、クローニングしたラインの中でハズレの（ノックアウトされていなかった）細胞株をコントロールにするという考え方もある。

CRISPR/Cas9でKnock outした細胞のコントロールについて 削除/引用
No.4091-1 - 2015/05/13 (水) 15:21:44 - OSK
初めてトピックを立てさせていただきました。宜しくお願いします。

Crisper/Cas9　システムを使用し、Huh7.5細胞という肝癌cell　lineのある分子をノックアウトした細胞を作製しました。その細胞とPBMCなどを共培養して免疫能を評価したいのですが、コントロールの細胞はどのような細胞になるでしょうか。

純粋にHuh7.5細胞とPBMCでの共培養群がコントロールになるのか
それとも
Huh7.5細胞にCrisper/Cas9でプラスミド？だけtransfectionした細胞＋PBMCで共培養した群がコントロールになるのか？

SiRNAによるノックダウンのときはSi controlといったものがあると思いますが、Crisper/Cas9によるノックアウトの際もSi controlに相当するものは作製できるのでしょうか。

Crisper/Cas9について十分理解できていないのが原因かと考えておりますが、ご教授のほどよろしくお願いいたします。
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