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(無題) 削除/引用 No.4090-7 - 2015/05/14 (木) 07:25:09 - おお C18では塩で結合させるというのはあまりポピュラーじゃありません。 その基質にリン酸がついたものを合成したものが手に入らないでしょうか?少なくともdot blotのポジコンにはなると思います。量が許すならカラムの条件の検討にもつかえるかと。 かかれている様子からみるとペプチドをつかった基質のようなので、ペプチドのスタンダードなプロとコールのほうがいいかと思いますが。 蟻酸、TCAやTFAを加えて遠心して上澄みをC18に載せる方法です。C18はシリカベースなのでたいてい酸性でつかいます。COO-の電荷がミュートされるように強力な酸を使うことが多いです。 Tritonが気になるならクロロフォルムとかで有機相に吸収させてという方法もあるかと思いますが、、、そんなに邪魔するかなぁというきもします。ただし感覚的で科学的ではありませんけど。

(無題) 削除/引用 No.4090-6 - 2015/05/14 (木) 06:03:32 - mon ステップを分解して検討してみればいかがでしょうか。 いくつか懸念点があります。例えば、 (1)細胞溶解法・反応液：PBS＋1％ TritonX100 >活性保護に還元剤、protease inhibitorは不要か？ PBS（過剰のリン酸）は問題無いか？Tris buffer, HEPES bufferが良い？ 脱リン酸化酵素阻害剤は不要か？ TritonX100ではなく凍結融解で抽出してはダメ？ (2)濃縮法：Sep-Pak ＞同じ条件で基質は結合する？リン酸化されると疎水性は減少する（親水性が増す）けど結合するか？ 反応液にアセトニトリルを添加して(Tritonの吸着を抑制し）目的物を吸着、100%（？）アセトニトリルで溶出とか？ カラムを使わずクロロホルム抽出＋乾固ではダメ？ (3)検出系：ドットプロット＋リン酸化抗体 ＞問題無い？、濃縮せず反応液を直接ブロットしたら（高感度試薬を使う）？ あるいは、（反応液に脂質フリーBSAを添加しておき）基質をBSAに吸着させて、とか。 先行論文があるなら、使用したドットプロット膜（薄層？）・検出抗体は同じ物か？ (4)原理を変える＞例えば反応液を乾固（あるいはクロロホルム抽出＋乾固）してTLCで展開・検出出来ないか？

(無題) 削除/引用 No.4090-5 - 2015/05/14 (木) 01:51:33 - カラム初心者 おお様 コメント頂き有り難うございます。また詳細な条件を書かず、申し訳ないです。 細胞を1％トリトンX100 in PBS中で溶解し、低速遠心で核やデブリを除いたものを酵素源に、人口基質に1時間リン酸化反応（50マイクロリットルのスケール）を行わせました。その後、水で20倍に希釈し、人工基質をSep-Pakで吸着させ、1-ブタノールで溶出を行っています。 溶出物を濃縮し、ドットプロットでリン酸化抗体で見ていますが、溶出分画には何も現れません。 論文通りに酵素反応は行っているのですが、正直なところ、どこに問題があるのか現時点で不明です。酵素反応がそもそも起きていないのか、リン酸化基質がC18に結合していないのか、溶出されないのか。酵素を過剰発現させたライセートを使ってもドットプロットの結果は変わらずでしたし、溶出もメタノールやクロロホルムも試してみましたが、だめでした。 C18の性質から考えると、塩が全くないこと、トリトンX100がC18にかける際の終濃度が0.025％ほどになっています。こういったことが原因として考えられますでしょうか？もしご存知でしたら教えてください。

(無題) 削除/引用 No.4090-2 - 2015/05/13 (水) 14:42:20 - おお トリトンx100もしいて言えばつきそうですけど。。。 どの様な条件で吸着しようとしているのでしょうか? 実際に目的のものが素通りしていることは確認していますでしょうか?FTにものが検出されますか?

Sep-Pak C18について 削除/引用 No.4090-1 - 2015/05/13 (水) 14:07:45 - カラム初心者 初めてトピックを立てさせていただきました。宜しくお願いします。 論文通りに行っているのですが、Sep-Pak c18カラムに目的の化合物（疎水性が高いです）が結合せず参っています。 C18とその化合物との結合は疎水性相互作用によるものと理解していますが、サンプル中にはトリトンx100が0.1%ほど入っています。疎水性相互作用は、私の記憶が正しければ、界面活性剤存在下では弱まってしまいますよね？0.1%では高過ぎるということでしょうか？ またサンプル中にはNaClが全く含まれていません。疎水性相互作用はNaClの濃度が高いほど上昇すると記憶していますが、それも原因でしょうか？ 非常に分かりにくい説明で恐縮ですが、宜しくお願いします。

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