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(無題) 削除/引用 No.4080-14 - 2015/05/10 (日) 01:28:27 - おお IPでのノンスペをへらすにはtweenいがいにTriton x100やNP-40を使うという手もあるかとおもいます。濃度は0.1-1%ぐらいがよく使われると思います。 ただしtweenもそうかもしれませんがこのようなdetergentを使った場合ちょくにMSに持ち込むと分析の邪魔になるのでSDSPAGEなどに持ち込むことがたいていです。

ありがとうございます（5） 削除/引用 No.4080-13 - 2015/05/09 (土) 23:42:27 - CI おお様＞ いろいろな要素を考えなければいけませんね。 control IgGで得られたノンスペは本当にあなたの欲する蛋白かどうか →おっしゃる通りですね。とりあえず手元にある別の抗体での確認も検討してみます。 q1w23e4r5t6y7u8i9o0様＞ どうもありがとうございます。 おっしゃる通り、IP自体や抗体がいけていない可能性も考えなければいけませんね。 MSを念頭においていたので、ビーズの洗浄以外のステップ（添付文書で0.01%BSA/PBSとあり）では、BSAを使用していませんでした。 もともとバックグラウンドは高くなく、目的タンパクと思われるバンド＆グロブリンと思われるバンドがみられていました。 指導者のコメント通り、ビーズのブロッキング、使用する血漿タンパク濃度の変更、ビーズとのインキュベーション時間の変更、Tweenによる洗浄追加にてバンドの濃さに差はみられるようになりましたが、今なおCont-IgGにてもバンドがみられている状況です。 MSに持っていくまでにいくつか片づけなければならない問題があるので、ひとつずつクリアーにしていきます。

(無題) 削除/引用 No.4080-12 - 2015/05/09 (土) 21:31:48 - q1w23e4r5t6y7u8i9o0 IgGって量にもよるけどWBやるとHとLの位置以外にもいろいろマイナーなIgG由来のシグナルでるよ。で、そういうIgG由来だとか、（今回は関係ないけど）protein Aだの由来のものがはBGになる。IP-WBのBGってそういうのに起因するの多い。2次抗体だけでWBしてもそのバンド出るかどうか見たかな？Ab-IPもnormal igG-IPもそのバンドのシグナル強度は同じくらいならそういうものがたまたま、目指す蛋白質の位置に来ただけで、言い合えればIP自体がいけてないか、WBの抗体が残念なものだったか、あるいは両方かじゃないかな？もしAb-IPの方がシグナルが明らかに濃ければ、一応IPは成功しているとおもうので、control-IPのシグナルの件は当座は本質的な問題じゃないので置いといて先に進めるとおもうけど。 あとIPで精製してMSやるならそのときはIPでBSA使用は止めた方がいい。BSAって実際にはアルブミン以外にもいろいろ素性の不確かなマイナーな血漿蛋白質結構まじってるし、なにも精製するものに好き好んでわざわざよけいな蛋白質を自分で持ち込む事のって普通に考えてどうよとか思うので。特に血漿を精製材料しているわけで、精製画分にそういうのが残存していると結果の解釈で混乱する可能性もあるし。 てか、血漿とか血清からIPやると、べつにビーズのブロッキングとかしなくても、以外かもしれないけど組織と比べてBGはかなり少ないよ。もともと水に溶けやすい蛋白質だからかもしれないけど。

(無題) 削除/引用 No.4080-11 - 2015/05/09 (土) 13:58:38 - おお ではまずスペシフィックについていろいろわけて考えましょう。 control IgGはあなたのターゲットの蛋白(あるいはその一部のペプチド)を打たないで、動物から得たものです。なのでそのIgGのエピトープ認識部位はあなたの蛋白を認識しないか、認識するとしても非常に限られた量でしょう。その動物は環境などに対していろいろな蛋白などに対する抗体をもっているでしょうから(というのがcontrol IgGの前提です)。 そのIgGが、エピトープ認識部位を介してあなたの蛋白をIPで捕らえることはないと考えられるわけです。なのでそれにもかかわらずあなたのタンパク質がIPされるなら、抗体の特異性によらないノンスペだといえます。 たまたまあなたのターゲットが抗体の特異性によらないノンスペでIPで落ちてきたとしましょう。それをWBで検出したならWBではスペシフィックなバンドではあるはずです。 ここでひとつ考えないといけないことがありますcontrol IgGでえられたノンすぺは本当にあなたの欲する蛋白かどうか。たまたまそうじゃないものがIPされて、WBでもノンすぺであっても抗体で認識されたら(たとえばIgGにエピトープ認識部位以外に結合して、WBでもIgGに親和性があるのでシグナルが出たとか)。たまたまそれがあなたのターゲットと同じサイズに出るなら、あなたは関係のないタンパク質もどうじにMSにかけることになってしまいます。 また血漿を直接WBしたときの蛋白は果たして本当にあなたが考えている蛋白を検出しているのかという疑問も出てきます。 control IgGをネガこんとして使っている限りネガにでないとその系は信用できないということです。

ありがとうございます（4） 削除/引用 No.4080-10 - 2015/05/09 (土) 00:12:30 - CI 抗原特異性という意味でcontrol IgGにもあなたが使っている抗体のような作用があるなら、そのバンド以外にも、あなたが期待しているサイズにくるバンドが検出されるとおもいませんか? →期待しているサイズ＆グロブリンの軽鎖＆重鎖レベルにのみバンドがあるのです。つまり、実験をすすめている抗体Aとcontrol IgGでまったく分子量のところにバンドがあります。それ以外に確実にノンスペといえるバンドはありません。 血漿をIPせずにそのままWBしてそのバンドが検出できますか? →抗体Aとcont IgGと血漿（non-IP）で全く同じ分子量のところにバンドがみられます。

(無題) 削除/引用 No.4080-9 - 2015/05/08 (金) 22:41:18 - おお >[Re:8] CIさんは書きました : > Cont IgGのバンド、あまりにもはっきりしたバンドだったので、ノンスペという認識がなかったです。 > マウスIgGにも私が使っている抗体のような作用があるのかもと解釈してしまっていました。 > ノンスペを減らすべく、色々と工夫してみたいと思います。 > 抗原特異性という意味でcontrol IgGにもあなたが使っている抗体のような作用があるなら、そのバンド以外にも、あなたが期待しているサイズにくるバンドが検出されるとおもいませんか? スペシフィックな抗体ではないので、目的のものを抗体が吸着していないと考えると、あなたの探しているものではない可能性が高いですよね。そう言う意味ではノンスペだとおもいます。 ただスペシフィックというのは定義も興味によってかわり、興味ある抗体で認識されるバンドとみると、人によってはスペシフィックというかもしれません。 一ついえることは、あなたの血漿成分にはビーズやIgGのおそらく抗原認識部位以外のぶぶんについて、回収されなおかつ、WBで検出されるタンパク質があるといえるでしょう(違う可能性もいくらか残ってますけど)。 興味があるなら解析してみてもいいのですよ。WBのextraなバンドから新たな蛋白が見つかったっていう報告はいくらかありますし。 血漿をIPせずにそのままWBしてそのバンドが検出できますか?

ありがとうございます(3) 削除/引用 No.4080-8 - 2015/05/08 (金) 10:42:25 - CI Cont IgGのバンド、あまりにもはっきりしたバンドだったので、ノンスペという認識がなかったです。 マウスIgGにも私が使っている抗体のような作用があるのかもと解釈してしまっていました。 ノンスペを減らすべく、色々と工夫してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.4080-7 - 2015/05/08 (金) 07:51:32 - おお BSAをブロッキングで使うとMSで検出される可能性はありますね。ただ、関係ないノンスペをひっかけて、結果の解釈がわからなくなるよりはいいかと思います。 Triton x 100とかもう少し強めのdetergentをつかうとか、detergent 濃度をあげるとか、塩濃度やpHで最適な条件を見つけるというのも方法論です。 ブロッキングやこういうノンスペは絶対的な方法がなくわたしも、最近とぴを立ててきいているところです。 http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?mode=view;Code=4075

ありがとうございます（2） 削除/引用 No.4080-6 - 2015/05/08 (金) 06:33:22 - CI そのControl IgGで出るバンドはあなたの目的の抗体をつかったIPでもでますか? → 同じレベル（分子量）に、ほぼ同じ太さのバンドがみられました。 サンプル量、インキュベーション時間を減らしたところ、Cont IgGでのバンドはやや薄くなりましたが。 今回の結果を受けて、ELISAを再度やりなおしましたが、ContIgGではシグナルがないことを確認しています。

(無題) 削除/引用 No.4080-5 - 2015/05/08 (金) 06:16:07 - おお >質問1 >異好性抗体による偽陽性 平たくいうとあなたが書いていることを含め、ノンスペをへらすためです。ちゃんとしたあなたのターゲットを認識する抗体であってもwellに直接くっついちゃったら検出できないでしょう。 またIPのビーズに直接関係のない蛋白がくっついちゃうと質量分析のじゃまになるでしょう。 >質問2 >電気泳動でCBBで検出されるレベルのビーズに直接つくタンパク質がない あなたの目的のタンパク質がCBBではっきりと見えるぐらいなら、MSでもあまり邪魔しないかもしれません。ただCBBの感度をかんがえれば(あるいは使うMSの感度によっては)、MSでもそれなりの量だと思いますが、、、 実験にもよると思いますので、IP用のビーズをブロッキングしないばあいもありますが、じっさいにControl IgGでバンドがでてるわけでしょ。何か目的と違う蛋白をひっかけていて、それがあなたの抗体で認識されているのはたしかですよね。そのControl IgGで出るバンドはあなたの目的の抗体をつかったIPでもでますか?

ありがとうございます 削除/引用 No.4080-4 - 2015/05/08 (金) 05:42:56 - CI 質問1 異好性抗体による偽陽性を減らす目的でよろしいでしょうか。 ELISA系を立ち上げた際にその目的で追加したみたいです。 質問2 電気泳動でCBBで検出されるレベルのビーズに直接つくタンパク質がないことは確認しました。 質問3 グロブリン分画とはあきらかに違う分子量のところにバンドがみられています。 追加質問 IPとWBでは違う抗体を使っています。

(無題) 削除/引用 No.4080-3 - 2015/05/08 (金) 05:21:13 - おお IPとWBでおんなじ抗体つかってるんかな?

(無題) 削除/引用 No.4080-2 - 2015/05/08 (金) 05:14:44 - おお 質問1 BSA＋Tweenがはいってるんだからその役割を考えたらわかりますよね。逆にELISAではBSA＋Tweenをなぜいれたんですか? 質問2 そういうばあい2次抗体っていうかわかりませんけど、ビーズに直接つくタンパク質があってそれが質量分析のさい検出されたらどうしますか? 質問3 あるよ。 IgGかもしれんけど。

Pan Mouse IgG Dynabeadsを用いてのpull-down assay 削除/引用 No.4080-1 - 2015/05/08 (金) 04:51:00 - CI いつも勉強させていただいています。 初心者でして、初歩的な質問かと思いますが、どうぞよろしくお願いします。 グループリーダーが開発した、あるタンパクを認識する抗体と血漿をインキュベーション（質問1）。 Pan Mouse IgG Dynabeadsを加えて（質問2）、目的タンパクを抽出。 WBを施行しています。 最終的には、タンパク質質量分析を施行したいと考えています。 つい先日のWBでは、Control IgGでのpull-downにてもバンドがみられてしまいました。 exposure time 1分でも検出されるようなバンドなのですが、指導者はノンスペという認識（質問3）。 そこで質問。 質問1→ELISAではこの抗体はよくworkすることがわかっているため、血漿を希釈するにあたり、ELISA同様にBSA＋Tween入りバッファーを使用するように強く言われました。PBS希釈ではだめなのでしょうか？PBSとの違いを教えていただければと思います。 質問2→0.01%BSA入りPBSでの洗浄は行っていたのですが、指導者より2%BSA PBSでブロッキングするように指導されました。いってみればこの抗体は2次抗体。ブロッキングする必要があるのでしょうか。 質問3→この系においてノンスペの可能性はあるのでしょうか。 もちろん指導者にきけばわかることなのですが、質問1-3まで当たり前のようにいわれてしまいまして、頭の中が整理できていません。 お手数をおかけしますが、よろしくお願いします。

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