Bio Technical フォーラム

  • バイオ関連の実験をする上での、試薬、機器、プロトコールなどの情報交換の場です。
  • 新しいテーマで話を始める場合、質問をする場合は「新しいトピックを作る」から書き込みをしてください。
  • 質問に対して解答できる方は是非、書き込んで下さい。
  • このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。

新しいトピックを作る　|　トピック一覧　|　研究留学ネットに戻る

ひとつ前のフォーラム（readのみ）

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

ORIGENE社 CRISPR-Cas9でゲノム編集 トピック削除
No.4079-TOPIC - 2015/05/07 (木) 15:42:30 - Yukiyuki
お世話になります。
現在、ORIGENE社 CRISPR-Cas9 ゲノム編集用ベクター（GE100018)でマウス癌細胞株に対して遺伝子破壊を試みております。guideRNAの設計は、CRISPRDirectで行っております（3種設計しました）。ベクターにはGFP遺伝子が組み込まれていますので、ソーティングによりGFP陽性細胞のみを採取し、十分細胞が増えた時点でWestern blotでタンパク質の発現を確認していますが、タンパク質発現の欠損が認められません。この試薬は、うまくいくかわからず、購入し検討を行っておりました。説明書に記載されている以外に、何か気を付けた方が良い点がありますしょうか。使用されている方がいらっしゃいましたらぜひご教授願えれば幸いです。
　
- このトピックにメッセージを投稿する -



全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

みなさまありがとうございます。 削除/引用
No.4079-6 - 2015/05/11 (月) 19:31:28 - Yukiyuki
はじめて投稿させて頂きましたが、ご親切にご回答して頂き恐縮です。GFP陽性細胞が必ずしも遺伝し破壊されているわけではないことがよく理解できました。一方、メーカーのデータですとGFP発現が高いところをソーティングする事よって遺伝子破壊効率が飛躍的に上昇することが示されていましたので、GFP発現が高いところをソーティングしバルクでWestern blotを行っておりました。次は、みなさまのご指摘通り、シングルコロニーを形成させ、その細胞の遺伝子破壊について検討したいと思います。また、おお様のアドバイスでもう少し時間をおいたものも検討したいと思います。本当にどうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.4079-5 - 2015/05/09 (土) 15:56:47 - おお
ああ、ソートしたやつを一つづつシングルクローンとして増やしているんじゃないのか、、、まとめちゃったら難しいよなぁ。。。

シングルクローンからふやして、とにかくシーケンスでヘテロがみつかればもう一度トランスふぇくしょんという手も取れる。

(無題) 削除/引用
No.4079-4 - 2015/05/09 (土) 15:36:40 - 7744
GFP+を集めて解析してもほぼ意味は無いですよ。
おそらくGFP+のなかでもheteroとwildがほとんどなはずなので。

GFP+が意味するところは、ベクターが細胞に入り、ベクターに乗っている遺伝子が発現している、という保証にしかなりません。

CRISPRで遺伝子を破壊した細胞を解析したいのであれば、Selさんの仰るように、限界希釈法等でシングルセル由来のコロニーを複数回収し、それぞれに対して標的部位のmutation（ホモ or ヘテロ、フレームシフトしているかどうか）がどのようになっているのかを調べる必要があります。

(無題) 削除/引用
No.4079-3 - 2015/05/09 (土) 14:26:15 - おお
導入効率とタイミングが鍵のようなきがします。
transfectionのあと培養を長めにやってからソートしたらどうかな。長期間発現していて、編集が起こるのに十分な時間が与えられている細胞をとるために。

(無題) 削除/引用
No.4079-2 - 2015/05/09 (土) 00:29:32 - Sel
>ソーティングによりGFP陽性細胞のみを採取し、十分細胞が増えた時点で

この部分の実験操作はどのようにされていますか。
分取したGFP陽性の細胞を一緒くたに解析しているわけでは無いですよね。

細胞の性質にもよりますが、遺伝子破壊株を樹立する際には、
限界希釈法等でシングルセル由来のコロニーを形成させ、
エンドヌクレアーゼで標的領域の切断・変異が生じているクローンを選抜し、
ゲノムを読んで両アリルの遺伝子破壊が生じているか確認する、
といった流れが一般的なはずです。
シークエンス上ではきちんと破壊されているにもかかわらず、
ウエスタンで検出されるということでしょうか。

場合によっては、ターゲティングベクターを併用して
薬剤選択したほうが早く樹立できるかもしれません。

ORIGENE社 CRISPR-Cas9でゲノム編集 削除/引用
No.4079-1 - 2015/05/07 (木) 15:42:30 - Yukiyuki
お世話になります。
現在、ORIGENE社 CRISPR-Cas9 ゲノム編集用ベクター（GE100018)でマウス癌細胞株に対して遺伝子破壊を試みております。guideRNAの設計は、CRISPRDirectで行っております（3種設計しました）。ベクターにはGFP遺伝子が組み込まれていますので、ソーティングによりGFP陽性細胞のみを採取し、十分細胞が増えた時点でWestern blotでタンパク質の発現を確認していますが、タンパク質発現の欠損が認められません。この試薬は、うまくいくかわからず、購入し検討を行っておりました。説明書に記載されている以外に、何か気を付けた方が良い点がありますしょうか。使用されている方がいらっしゃいましたらぜひご教授願えれば幸いです。
全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する
名前 
メール  　アドレス非公開
   タイトル 
本文      
設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます）
上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません）
解決（問題が解決した際にチェックしてください）
暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。
送信 
〔使い方〕
  • 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。
  • 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。
  • 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。