BioTechnicalフォーラム [ほ乳動物細胞においてタンパク質が発現が確認できない]

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(無題)

No.4067-3 - 2015/05/03 (日) 10:52:55 - YK

すみません、書き忘れてしまいました。
レンチベクターのプロモータはEF1alphaです。繊維芽細胞でも血球系細胞でも働くはずのものです。

(無題)

No.4067-2 - 2015/05/03 (日) 10:41:20 - YK

IRESの下の遺伝子発現（今回の場合はEGFP）はIRES上流遺伝子の種類によって影響を受けることは知っています。ただ、今回のようにタンパク質Xをコードする遺伝子をIRESの前に持って行くと完全にEGFPの発現が消えてしまうなんてことは初めてで困惑しています。この場合、タンパク質Xの安定性云々よりは、翻訳がなぜか落ちてしまうと考えています。

どうしてもこの二種の細胞で導入したタンパク質Xの翻訳後修飾がみたいです。
このタンパク質の発現を検出できるような方法でおすすめがありましたら、ご教示いただけないでしょうか？非常に分かりづらい質問で申し訳ありません。

私に思い浮かぶ新たな手段として、

タンパク質X-mycx3/pcDNA3.1を血球系細胞にエレクトロポレーションするとことまで一緒ですが、そこへSV40 large T抗原をco-transfectしてはどうだろうかと考えています。が上手くいくでしょうか・・

ほ乳動物細胞においてタンパク質が発現が確認できない

削除/引用

No.4067-1 - 2015/05/03 (日) 10:37:30 - YK

お世話になります。行き詰まってしまいトピックを立てました。
どうかご教授いただけますと幸いに存じます。

私は今あるタンパク質Xに注目しています。全長1000アミノ酸ほどの大きさで、内在性のタンパク質レベルは極めて低く、ウエスタンでの検出はできません。
私の目的は、このタンパク質Xを二種類の細胞（ヒト繊維芽細胞とヒト血球系細胞）に発現させ、タンパク質Xに見られる翻訳後修飾の差異を比較することです。

このタンパク質Xは、Scienceの論文にて、BHK細胞において全長の発現が理由不明で困難だったとありました。その論文ではdeletion mutant（C末にタグ）を使ってなんとか過剰発現させています。

そこで私も全長およびdeletion mutantのタンパク質X発現ベクター（pcDNA3.1）を作り（C末にV5-Hisx6タグ）、293TやCHOにPEIにてトランスフェクトしたところ、予想通りのバンドが確認されました。しかし、私の目的の二種類の細胞では発現が確認されず困っています。
以下にこれまでの流れを書きます。

1. タンパク質X -V5-Hisタグ/pcDNA3.1をエレクトロポレーションで血球系細胞に導入すると、タンパク質がwesternでは検出されない。一方、pEGFP-N1の導入効率は8割です。

2. タンパク質X -V5-Hisタグ/レンチウイルスベクター(+PuromycinR)を作成し直し、血球系細胞に感染させ、Puromycinでセレクションしたところ全てが死んでしまった。別に調製したEGFPを発現するレンチベクターを感染させた方では5%の感染効率でした。

3. タンパク質X -V5-Hisタグ/レンチウイルスベクター(+PuromycinR)を繊維芽細胞に感染させた後、48-72時間後にwesternをしたがタンパク質Xは検出されなかった。別に調製したEGFPを発現するレンチベクターを感染させた方では50%の感染効率でした。

4. 検出感度をあげるためタンパク質X -mycx3タグをIRES-EGFPの上流に挿入させたレンチベクターを作成し直し、繊維芽細胞に感染させたところfilmへのover nightでのexposureでかすかなbandが検出されたが、再現が取れない。Flowcytometryにより、ベクターコントロールのベクターを感染させるとIRES下のEGFPの発現が50%ほどの細胞で確認されたが、タンパク質Xを挿入した場合にはEGFPは確認できなかった。このプラスミドをregular transfectionで293Tに導入するとタンパク質Xの検出感度がV5-Hisのものにに比べ圧倒的に上昇していることは確認しています。またIRES下のEGFPもしっかり確認されています。

5. タンパク質X -mycx3タグをIRES-EGFPの上流に挿入させたレンチベクターを血球系細胞に感染させたところ、ベクターコントロールベクターを感染させた場合には5%ほどの細胞がEGFPが陽性になりましたが、タンパク質Xを導入したベクターではwesternでタンパク質Xが確認されないだけでなく、EGFPの発現も確認できませんでした。

6. 10 uM クロロキンで8時間（導入後40-48時間目）処理や、20 uM MG132で8時間（導入後40-48時間目）処理してもタンパク質Xの発現は確認できませんでした。

わかりずらく申し訳ありませんm(__)m
血球系細胞へのエレポでの導入効率は非常に高いものですし、hyper-sensitiveなmycx3タグを作って、更にMG132処理をすればなんとか見えるのではないか、と期待していたのですが、だめでした。

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