平素は大変お世話になっております。
細胞内小器官の膜に局在する膜タンパク質をウエスタンにて検出したいのですが、ホールのセルライセートでは見えませんでした。過剰発現したものではしっかりと検出されるので、抗体はウエスタンには使えそうです。
研究施設にはダウンス型ホモジナイザーがなく、できれば核と細胞質を除いたものを調製したいと思っていまして、ハイポトニックバッファーで細胞を処理してみましたが（2mM Tris-HCl, pH7.5, 5 mM MgCl2, 5 mM CaCl2, 1 mM DDT, 1mM EDTA + Protease inhibitors cocktail）、鏡顕下では細胞が破裂していなさそうでした。p１０チップをp1000ピペットの先端につけてピペッティングしてみましたが、1000gで遠心してもペレットの大きさはピペッティングの有無では変わらずでした。
本当はダウンス型ホモジナイザーで処理したいのですが、施設にありません。ソニケーターは施設にありますが、核が壊れるため、他の方法を探しています。
そこでTx114を利用した方法があるとこちらで拝見しました。
回収効率はいかほどでしょうか？
古い論文で見たTx１１４の調製方法は単純ではないようですが↓このように調製するというのは今でも変わらずでしょうか？
ttp://cail.cn/cail-protocols/B18.pdf
私の目的はSDS-PAGEでゲルにアプライするタンパク質量（このうち、ほとんどを膜タンパク質に）を増やして、なんとか内在性の膜タンパク質をみるというものです。細胞は不死化したB細胞ですので、どんどん増やせられます。
また、20℃がTx114の曇点のようですが、それ以上の温度に設定できる高速遠心機がありません。
室温のもので、２５度くらいにはなりますが、それ以上に上昇させることはできません。
また沈殿させたTx114の分画に直接SDSサンプルバッファーを入れて、その後SDS-PAGEをしたらよいでしょうか？ゲル内のTx114濃度が高すぎる事で何か問題は起きえますでしょうか？
このような環境の下で、挑戦する価値のある手法でしょうか？
大変稚拙で恐縮しておりますが、どうかよろしくお願いいたします。
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