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(無題) 削除/引用 No.4065-12 - 2015/05/03 (日) 18:33:25 - qw ENCODEは役に立たんかなあ？ ttps://www.encodeproject.org/ IGV (ttps://www.broadinstitute.org/igv/) からENCODEのデータをDLすると、ある一定の条件でのヒストン修飾がみえるようです。

(無題) 削除/引用 No.4065-11 - 2015/05/03 (日) 13:23:23 - 遊chem おおさん、monさん アドバイスの方ありがとうございます。 一度、いただいた情報から使用する実験手法を検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.4065-10 - 2015/05/03 (日) 05:41:50 - おお >[Re:6] おおさんは書きました : > ちょっと現実的かわからないですけど、大胆なアイデアとしてHAC(human artificial chromosome)に見たい領域の最小単位でいれて、細胞からHACをクロモソームの状態で取り出せたら、そこに着いているヒストンなどを解析すれば、変化が起こっているかわかるかもしれません。 > > むかしにtransfectionしたプラスミドについているヒストンやクロモソームとしての構造を解析したというのを学会で見たことがあるので、小さなHACであればほかのクロモソームから分けれるのではないかと妄想しています。 TetO はいれつをHACに入れとけば、TetRでpull downできないかしら、、、あるいはさいぼうないでTetRを発現させといて、native chromatinからant-TetRでIPするとか。 まあ新規なほうほうでチャレンジングではありますけど

(無題) 削除/引用 No.4065-9 - 2015/05/03 (日) 03:38:16 - おお 本題ではないのですが、クロスリンクをつかわないChipなどもやられているようですね。 http://www.abcam.com/protocols/native-chromatin-immunoprecipitation-protocol http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15273401

(無題) 削除/引用 No.4065-8 - 2015/05/02 (土) 08:40:21 - mon あっ、感度が足りないかな？？

(無題) 削除/引用 No.4065-7 - 2015/05/02 (土) 08:03:28 - mon この場合、qPCRより、サザンブロット（ドットブロット）の方が定量性がありそうです。 -特定領域のPCR産物（混ぜてもよい）をナイロンメンブレンに（スポット）ブロットしておく。 (変化がないと思われる領域もネガコン・ポジコン用に複数用意する。） -各種抗体でChIPを行い、得られた全DNAを（RIやDIGで）ラベル。 -同量のラベルプローブをブロットメンブレンにハイブリ。 -各ChIPの結果（スポットのラベル量）を定量的に比較する。 とか。

(無題) 削除/引用 No.4065-6 - 2015/05/02 (土) 07:27:43 - おお >また、ちょっと今思い出せないのですが修飾されたりしたアミノ酸がアルデヒドに反応性があるのかなどいくらか調べてみた方がいいかもしれません。 あ、これはChipができる抗体があるなら心配する必要はなかったですね。失礼しました。 ちょっと現実的かわからないですけど、大胆なアイデアとしてHAC(human artificial chromosome)に見たい領域の最小単位でいれて、細胞からHACをクロモソームの状態で取り出せたら、そこに着いているヒストンなどを解析すれば、変化が起こっているかわかるかもしれません。 むかしにtransfectionしたプラスミドについているヒストンやクロモソームとしての構造を解析したというのを学会で見たことがあるので、小さなHACであればほかのクロモソームから分けれるのではないかと妄想しています。 ヒストンの修飾はそれぞれの抗体を使うのがわかりやすいかと思いますが、2Dなどでみればある程度修飾された分子種をわけれるかもしれません。塩基性がつよいので、等電点電気えいどうがちょっとコツがいるかもしれませんけど。 等電点でなければisotachophoresisとか液クロとかでもいけるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4065-5 - 2015/05/01 (金) 22:58:39 - 游chem おおさん ご回答ありがとうございます。 自分で考えたやり方は、色々と問題があるようですね。。。 すこし、状況を詳しく書きますと 今、私の行っている研究の作業仮説では、特定の刺激を加えた後、その刺激の表現型もたらすのに重要ヒストン修飾があると仮定しています。（ないかもしれません。。） 過去の報告例などからターゲットは絞りたいと思いますが、ある程度網羅的に調べてみたいという希望があります。 ヒストン修飾にはヒストンH3、H4、H2A、H2Bとあり、修飾もリン酸化、アセチル化、メチル化とあります。また、修飾部位も多くあります。その中から「ヒストンH3のアセチル化が重要そう」などとターゲットを絞りたいのです。 例えば、アセチル基に対する抗体でChIPをして特定の領域を細かく見ていけば、重要な修飾は分かるかもしれませんが、どのヒストンに対する修飾なのかがわかりません。ここがネックと考えています。 もし何か良い案がありましたら、ご教示していただけると幸いです。 （調べたい領域は、TSSから上流1000bpぐらいです。)

(無題) 削除/引用 No.4065-4 - 2015/04/30 (木) 12:57:18 - おお Chip on chipというのがあって、ChipのあとクロスリンクをといておそらくPKなどで蛋白を消化してえられたDNAをラベルしてマイクロアレーをつかってはいぶりすることはあります。ハイブリのために蛋白をよけるわけですから。。。 ハイブリはクロスリンクされた状態でどれくらい有効か、クロマチンの状態のちがいで効率がかわらないかどうかなどが懸念です。すくなくともいちいちその辺を探りながらまずは条件を定めていかないと何がいえるかわからなくなる可能性があります。その辺の実験計画ができるならやってみるといいでしょう。 またX-linkされた蛋白はいろいろとクロスリンカー(アルデヒド)で修飾されているので、そのために移動度が変わったりするかもしれません。また、ちょっと今思い出せないのですが修飾されたりしたアミノ酸がアルデヒドに反応性があるのかなどいくらか調べてみた方がいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4065-3 - 2015/04/30 (木) 11:28:24 - おお どれくらいの領域をカバーしたいのでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.4065-2 - 2015/04/30 (木) 11:23:34 - おお RTはしなくていいでしょう。それでも予算〜考えて高すぎますか?

特定のクロマチン領域のヒストン修飾解析法 削除/引用 No.4065-1 - 2015/04/30 (木) 11:01:21 - 遊chem こんにちは 現在、特定のクロマチン領域に多いヒストン修飾を低コストで解析できる方法を探しています。私が見たいのは、細胞に刺激を与えると特定のクロマチン領域で有意に変化するヒストンの修飾です。 なにか良い方法はないでしょうか？ RT-PCR用の試薬と抗体が制限なく購入できるなら、ChIPを行い、そして、特定の領域を重複しながらカバーする多数のプライマーセットを用意することでRT-PCRをかければ可能かもしれません。（手動のChIP-seqのようなもの)しかし、重要な変化があるのか、ないのか、もわからない手探りな状況ですし、現実的に予算の面で許可がおりません。 実現性はわかりませんが、１つアイデアがあり検討中です。それは、まず細胞内の蛋白質とDNAをクロスリンクさせてから、ソニケーションしてクロマチンを断片化させます。そして、特定クロマチン領域に相補的かつ特異的な配列をもつ多数のプライマーに化学修飾を加えて、それを抗体でIPします。そのIPしたものを電気泳動して、アセチル基を認識する抗体や特定のヒストンを認識する抗体でIBする方法です。これでどのような修飾が有意に変化しているのか絞れるのではないかと考えています。例えば、「ヒストンH3のどこかはわからないけどアセチル化修飾が有意に変化している」など・・・どう思われますか？ 低コストで特定領域に多いヒストン修飾を解析する方法がありましたら、ご教授ください。また、自分自身のアイデアが実現性があるのでしたら、プライマーにどのような修飾をどのような方法で入れれば良いのかご紹介していただけると助かります。(FISH関連を調べればわかりそうなので、自分でも調べてはみます。） ご教示宜しくお願い致します。

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