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7回膜貫通型タンパク質のN末タグは？ トピック削除
No.4060-TOPIC - 2015/04/29 (水) 06:38:16 - タグろう
今ちょっと新しい実験で多くの方の意見を聞ければと思ってとぴを立てています。

新しく7回膜貫通タンパク質を用いてFRETを行う予定です。
ほとんどの場合C末にタグをつけていますが、今回の実験ではどうしても細胞質側のタグが必要になりました。
この7回膜貫通型タンパク質はシグナル配列を持っていません。
タグはCFPをつける予定です。
いくつか検索したところ、別のタグを7回膜貫通タンパク質のN末につけていましたが、そのタグの前にシグナル配列もつけていました。
別の実験＆コントロールとしてCFPなしおよびFlagタグもN末につけたいのですが、そこで聞きたいのは、
1）シグナル配列ー全長の7回膜貫通タンパク質でも全長の7回膜貫通タンパク質と同じ挙動を示すのでしょうか？もちろん試してみればいいのですが、もしご存知の方がいましたら教えてください。
2）小さいタグ（Flag）でもシグナル配列をつけてその後ろにFlag、全長の7回膜貫通タンパク質とつなげるほうがいいのでしょうか？それとも小さいタグの場合はいきなりFlag-全長の7回膜貫通タンパク質でもいいのでしょうか？いったいどのくらい小さなタグだったらシグナル配列をつけなくてもこんふぉメーションが変わらず、膜に配列されるのでしょうか？

よろしくお願いいたします。
　
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(無題) 削除/引用
No.4060-5 - 2015/04/29 (水) 22:11:35 - タグろう
独り言さん、

CFPほどの大きさでもちゃんとER内に配向されるかちょっと不安でしたので聞いてみました。
ありがとうございます。

すいません。
間違っていました。
細胞内ではなく細胞外でした。

>[Re:3] 独り言さんは書きました :
> そのタンパク質がシグナル配列をもともともっていないのであれば、CFPの前にシグナル配列をつける必要はないです。
> おそらく最初の膜貫通ドメインが小胞体へのシグナルとなって、挿入されるのでしょう。そもそもCFPの前にシグナル配列をいれると、CFPは細胞外に向いてしまうと思う。

(無題) 削除/引用
No.4060-4 - 2015/04/29 (水) 22:07:50 - タグろう
サンショウウオさん,

ご自身の経験を教えてくれてありがとうございます。
それではCFPほどの大きさではやはりシグナル配列は必要と思われますか？
リガンドに対する影響も合わせて検討したいと思います。


>[Re:2] サンショウウオさんは書きました :
> うちのだとシグナル配列無しで約二十残基のタグ(HAタグとFLAG)をgpcrに直結して膜表面での発現を確認してます。
>
> CFPとかをGPCRにつけるばあい、わりとでかい+表面の極性残基のえいきょうがあったりするので、GPCRのリガンドに対する応答性やシグナル強度が低下することもあるので注意が必要です。(NとC末どちらでも悪影響が出たりする。)
>
>
>

(無題) 削除/引用
No.4060-3 - 2015/04/29 (水) 13:04:25 - 独り言
そのタンパク質がシグナル配列をもともともっていないのであれば、CFPの前にシグナル配列をつける必要はないです。
おそらく最初の膜貫通ドメインが小胞体へのシグナルとなって、挿入されるのでしょう。そもそもCFPの前にシグナル配列をいれると、CFPは細胞外に向いてしまうと思う。

(無題) 削除/引用
No.4060-2 - 2015/04/29 (水) 09:29:36 - サンショウウオ
うちのだとシグナル配列無しで約二十残基のタグ(HAタグとFLAG)をgpcrに直結して膜表面での発現を確認してます。

CFPとかをGPCRにつけるばあい、わりとでかい+表面の極性残基のえいきょうがあったりするので、GPCRのリガンドに対する応答性やシグナル強度が低下することもあるので注意が必要です。(NとC末どちらでも悪影響が出たりする。)

7回膜貫通型タンパク質のN末タグは？ 削除/引用
No.4060-1 - 2015/04/29 (水) 06:38:16 - タグろう
今ちょっと新しい実験で多くの方の意見を聞ければと思ってとぴを立てています。

新しく7回膜貫通タンパク質を用いてFRETを行う予定です。
ほとんどの場合C末にタグをつけていますが、今回の実験ではどうしても細胞質側のタグが必要になりました。
この7回膜貫通型タンパク質はシグナル配列を持っていません。
タグはCFPをつける予定です。
いくつか検索したところ、別のタグを7回膜貫通タンパク質のN末につけていましたが、そのタグの前にシグナル配列もつけていました。
別の実験＆コントロールとしてCFPなしおよびFlagタグもN末につけたいのですが、そこで聞きたいのは、
1）シグナル配列ー全長の7回膜貫通タンパク質でも全長の7回膜貫通タンパク質と同じ挙動を示すのでしょうか？もちろん試してみればいいのですが、もしご存知の方がいましたら教えてください。
2）小さいタグ（Flag）でもシグナル配列をつけてその後ろにFlag、全長の7回膜貫通タンパク質とつなげるほうがいいのでしょうか？それとも小さいタグの場合はいきなりFlag-全長の7回膜貫通タンパク質でもいいのでしょうか？いったいどのくらい小さなタグだったらシグナル配列をつけなくてもこんふぉメーションが変わらず、膜に配列されるのでしょうか？

よろしくお願いいたします。
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