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(無題) 削除/引用 No.4059-6 - 2015/04/30 (木) 06:32:28 - CHO培養者 monさん、 再度有用な情報、本当にありがとうございます。 細胞をもらった方が2x10^5からスタートしていたので、この細胞密度でいいのかなと思っていましたが、ぜひご指摘いただいたように、高密度で培養を試してみます。 もし、これが原因だった場合、どのような理由が考えられるのでしょうか？ 細胞自体が増殖因子等を出していて、ある程度の密度でないと増殖できないのでしょうか？ 以前Petri dishで培養した際には低密度でも大変よく増殖しました。 細胞はPetriに接着はあまりしていませんが、増殖因子等の物質があまり拡散しないため局所的に濃度が比較的高く保たれると考えると納得がいきます。 いずれにせよ試してみます。 monさん、ありがとうございます！ >[Re:5] monさんは書きました : > >[Re:4] CHO培養者さんは書きました : > > 3x10^5cells/mLの間違いでした。 > 市販の浮遊用CHO無血清培地だと 4x10^6cells/mL以上まで増殖すると思いますので、細胞が慣れるまで10^6cells/mL以上に保った方が良いかと思います。 > 自作の無血清培地DMEM/F12+ITS+CD-Liqiud Concentrate（+Yeastolate+PluronicF68）だと、1x10^6cells/mL以上に保たないと増殖が遅い〜しないです。

(無題) 削除/引用 No.4059-5 - 2015/04/30 (木) 06:18:01 - mon >[Re:4] CHO培養者さんは書きました : > 3x10^5cells/mLの間違いでした。 市販の浮遊用CHO無血清培地だと 4x10^6cells/mL以上まで増殖すると思いますので、細胞が慣れるまで10^6cells/mL以上に保った方が良いかと思います。 自作の無血清培地DMEM/F12+ITS+CD-Liqiud Concentrate（+Yeastolate+PluronicF68）だと、1x10^6cells/mL以上に保たないと増殖が遅い〜しないです。

(無題) 削除/引用 No.4059-4 - 2015/04/29 (水) 20:28:11 - CHO培養者 すいません。 3x10^5cells/mLの間違いでした。

(無題) 削除/引用 No.4059-3 - 2015/04/29 (水) 20:27:01 - CHO培養者 monさん、 いろいろと指摘していただきありがとうございます。 ＞細胞密度を濃いめに保つ（2~10x10^6cells/mL：最大密度は培地による)。 現在最低限3x10^6cells/mLに保っていますが、どんどん死んでいきます。 ＞Shearing Stressなら、回転数を落とすか、 回転数は最低90rpmを試してみましたがあまり効果がなかったです。 ＞PluronicF68を0.1%加える ご指摘の通り現在の培地には加えています。 ＞三角フラスコの形状が異なるものが入手できるならそれを試す。 フラスコは細胞をもらったラボとまったく同じものを使っています。 常に新品を用いています。 ＞液量を1/2に減らす、逆に2倍に増やしてみる。 これは試してみませんでした。 ぜひ試してみます。 ＞無血清培地なら血清を1~4%加えて回転培養に慣らし、次いで血清を減らして無血清培地に戻す。 培地を変えると細胞の性質が変わって、のちの実験に支障をきたすかもしれませんので、なるべく変えたくない部分で格闘しています。 ＞Petri dish培養した元気の良い細胞をトリプシン処理して回収、遠心x2回等でトリプシンを除去し、回転培養に戻す（この場合も細胞密度は濃いめ）。 これは試してみたのですが、効果がなかったです。 ＞回転培養をあきらめて、培養バックで行う。 ＞現実的か不明ですが、アポトーシスインヒビター(ROCK inhibitor)を使う これも試してみてません。 培地の量を変えることによってどうなるか見てみようと思います。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.4059-2 - 2015/04/29 (水) 12:51:24 - mon CHO細胞は丈夫な細胞だと感じていますが、培地・インキュベーターに問題が無いなら、ざっと思いつくままに。 細胞密度を濃いめに保つ（2~10x10^6cells/mL：最大密度は培地による)。 Shearing Stressなら、回転数を落とすか、PluronicF68を0.1%加える（既に培地に入っているかもしれませんが）くらいでしょうか。三角フラスコの形状が異なるものが入手できるならそれを試す。液量を1/2に減らす、逆に2倍に増やしてみる。 回転培養の三角フラスコは新品でしょうか。再生している場合はエンドトキシンが問題になるかも？ 無血清培地なら血清を1~4%加えて回転培養に慣らし、次いで血清を減らして無血清培地に戻す。 Petri dish培養した元気の良い細胞をトリプシン処理して回収、遠心x2回等でトリプシンを除去し、回転培養に戻す（この場合も細胞密度は濃いめ）。 回転培養をあきらめて、培養バックで行う。 現実的か不明ですが、アポトーシスインヒビター(ROCK inhibitor)を使う。

CHOのsuspension cultureで困っています 削除/引用 No.4059-1 - 2015/04/28 (火) 22:15:40 - CHO培養者 最近、コラボしている方から抗体を産生するCHO細胞をもらいました。 今まで接着細胞での実験経験はあったのですが、suspension cultureは初めてです。 CO2 incubatorの中にShakerをセットして、培養してみたところ、まったく増殖せず、どんどん死んでいきます。 培地はそのコラボレーターの方からもらってそのまま使っているので、間違いないです。 ShakerのスピードもCO2濃度もまったく同じ条件にも関わらずこのような問題が起きて困っています。 コラボレーターの方にもいろいろと相談したのですが、まったく解決が見えません。 一点だけ違うのが、ShakerのDiameterで、彼らが1 inchであるのに対して私たちは3/4 inchのShakerしかありませんが、彼らはそれが問題とは思えないといっています。 そこで自分たちのシステムに問題があるのか確かめるために、業者さんからCHO-Sを購入して培養したところ、大変よく増え、Viabilityもほぼ100％でした。 この抗体産生CHO細胞をPetri dishでShakerを使わずに培養したところ、大変よく増えますので、Shear Stressが問題と思っているのですが、どうしても後の実験のためにShakerで培養する必要があり困っています。 どなたか何かお気づきな点があればぜひ教えてください。

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