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(無題) 削除/引用 No.4054-11 - 2015/04/28 (火) 00:01:02 - IF ＞おおさま ありがとうございます。4%PFAで15分後固定してみます。

(無題) 削除/引用 No.4054-10 - 2015/04/27 (月) 23:10:02 - おお 通常クロスリンクをきたいしているのでアルデヒド系じゃないですか?PFAなど。 あとは蛋白のクロスリンカーに特化した試薬も使えるかもしれませんけど。

ありがとうございます。 削除/引用 No.4054-9 - 2015/04/27 (月) 22:44:36 - IF 皆さま、たくさんのアドバイスをいただきありがとうございます。返事が遅くなりすみません。大変助かります。 ＞Fさま Polyclonal同士の一次抗体を混合すると交差反応の可能性があるということでしょうか？ ＞Lさま ネガコンは一次抗体の代わりに抗体希釈バッファーのみを滴下しています。その他のステップはポジコンと同じです。 抗体Aの単染色での検討の際、希釈倍率は一次抗体1:200、二次抗体1:1000に落ち着いたのですが、二重染色に移った際にシグナルが弱くなってしまったため一次抗体の濃度を1:50、1:100に上げました。1:200の希釈倍率で、間に再固定をしてみたいと思います。 ＞組織さま 抗体Aの単染色での検討の際、希釈倍率は一次抗体1:200、二次抗体1:1000に落ち着いたのですが、二重染色に移った際にシグナルが弱くなってしまったため一次抗体の濃度を1:50、1:100に上げてしまいました。 二次抗体の濃度を上げる検討もしてみたのですが、バックのごみのような光が強くなってしまったため、一次抗体の濃度をあげました。情報検索したところ、蛍光二次抗体を使用する際に、遠心して凝集物を除く作業をしていませんでした。一次抗体の希釈倍率を1:200に戻して、二次抗体は遠心処理を行ってから使用してみたいと思います。 また、固定液は、メタノール-20度で10分間浸漬する方法を試しています（Cell signalingのページを参考にしました）。アセトンが手に入ったら、アセトンも試してみたいと思います。 ＞Monさま 二次抗体はどちらもPreadsorbedのものを使用しています。 ＞Lさま 抗体結合の可逆性については考えていませんでした。タンパクの回収等に関する経験がないため、勉強してみます。 ＞おおさま Washのあとの固定ぜひ試してみたいと思います。ちなみにお勧めの後固定法はありますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4054-8 - 2015/04/27 (月) 21:04:02 - おお 抗体Aの2次抗体反応、washのあと固定をかましてみてはどうでしょう。

(無題) 削除/引用 No.4054-7 - 2015/04/27 (月) 19:08:09 - L 抗体結合の可逆性について、気になります。Anti-Goatの抗A二次抗体がAの一次抗体に結合している状態（最初の二次抗体終了時）が不可逆であれば、次の二次抗体（Goat anti-rabbit）での染色に問題ないです。しかし、可逆的であれば、抗A抗体の抗原となる抗B二次抗体が二回目の二次抗体染色で過剰量（おそらく1:4000でも、組織に結合している抗A一次抗体と比べれば、相対的に過剰と考えます）で加えられた時に、抗A一次抗体と抗A二次抗体の結合が維持されるのかどうか、という事です。 例えば、FLAGの抗体でIPした後、変性しないでタンパクを回収する場合、過剰量のFLAGを加えて目的タンパクを抗体から分離したりしますよね？　この辺り、どうなんでしょう？

(無題) 削除/引用 No.4054-6 - 2015/04/27 (月) 16:52:40 - mon 二次抗体は、交差反応が起きないように他種IgGで吸収してある物でしょうか？ でないとすると、抗A二次抗体＞洗浄＞抗B二次抗体＞洗浄としていますが、Fさんも指摘しているように以下のどれか〜全ての交差反応がおきているのでしょう。 一次抗体A＞抗A二次抗体＞抗B二次抗体 一次抗体A＞抗B二次抗体 一次抗体B＞抗A二次抗体 （一次抗体B＞抗B二次抗体＞抗A二次抗体：操作順番から考えると余りなさそう）

(無題) 削除/引用 No.4054-5 - 2015/04/27 (月) 16:46:35 - 組織 二次抗体を分けているので、理論的には問題ないと思います。 ただ、一次抗体が濃すぎると思います。バックが高くなりそうです。そもそも単染色の設定条件は本当にうまくいっているのでしょうか？固定はホルマリンを使ってますが、アセトンとかの有機系固定液は試してみましたか？固定液の種類で、染色態度は大きく変わります。

(無題) 削除/引用 No.4054-4 - 2015/04/27 (月) 16:39:48 - L 抗A二次抗体（anti-Goat）が抗B二次抗体（Goat抗体）に結合している可能性があります。抗B二次抗体がFabで抗A二次抗体がFcにのみ結合するような場合でなければ、この組み合わせでの二重染色はお勧めできません。私なら、Aの染色を単独で二次抗体まで終了した後、再固定してからBの染色（一次抗体から）をします。ネガコンの染色は、具体的にどうしているのでしょう？ 凍結切片での経験はありませんが、パラフィン切片でも気管支上皮の自家蛍光がいつも問題になります。Aの単染色でのネガコンの蛍光レベルは大丈夫ですか？　気管支上皮のバックが高いようなら、一次抗体ではなく二次抗体の濃度を上げた方が良いかもしれません。抗体にもよりますが、CC10などClara細胞マーカーの染色で1:50はちょっと濃すぎるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4054-3 - 2015/04/27 (月) 15:42:37 - F これを混ぜた時点でなにが起こっているのか良く考えて欲しい。 >[Re:1] IFさんは書きました : > 【抗体試薬】 > 一次抗体A（気管支上皮のマーカー）　Goat polyclonal、希釈倍率1:50 > 一次抗体B（肺胞上皮のマーカー）　Rabbit polyclonal、希釈倍率1:25 > > 抗A二次抗体　Donkey anti-Goat, Alexa fluor 488　希釈倍率1:2000 > 抗B二次抗体　Goat anti-Rabbit, Alexa fluor 594　希釈倍率1:4000

蛍光二重染色（マウス肺、凍結標本） 削除/引用 No.4054-1 - 2015/04/27 (月) 15:27:01 - IF 現在マウス肺の凍結標本を用いて二重染色を試みています。 下記の条件で検討しておりますが、一次抗体Aのシグナルが十分に得られません。ネガティブコントロールのシグナル（特に気管支上皮で）が強いため、写真撮影の際に閾値を用いるとポジティブコントロールのシグナルがほとんど消えてしまいます。ネガティブコントロールのシグナルは全てのフィルターで確認されます。 蛍光染色を始めて3ヶ月の初心者なのですが、周囲に詳しい人がいないため、十分に相談できる相手がおらず困っております。改善できる点などございましたら、ご教示いただけますと大変助かります。 【抗体試薬】 一次抗体A（気管支上皮のマーカー）　Goat polyclonal、希釈倍率1:50 一次抗体B（肺胞上皮のマーカー）　Rabbit polyclonal、希釈倍率1:25 抗A二次抗体　Donkey anti-Goat, Alexa fluor 488　希釈倍率1:2000 抗B二次抗体　Goat anti-Rabbit, Alexa fluor 594　希釈倍率1:4000 【プロトコール】 １．凍結切片前固定　４％パラホルムアルデヒド　15分 ２．TBSTで洗浄　5分×3回 ３．Dako protein block bufferによるブロッキング 室温1時間 ４.一次抗体A、Bの混合液でインキュベーション　４℃、一晩 ５．TBSTで洗浄　5分×3回 ６．抗A二次抗体（Donkey anti-Goat, Alexa fluor 488）でインキュベーション　室温１時間 ７．TBSTで洗浄　5分×3回 ８．抗B二次抗体（Goat anti-Rabbit, Alexa fluor 594）でインキュベーション　室温１時間 ９．TBSTで洗浄　5分×3回 １０．DAPI含有封入剤で封入 いずれの抗体も単染色で条件検討を行った際には、十分なシグナルを得ることができていましたが、二重染色に取り掛かったところ一次抗体Aのシグナルが弱くなってしまいました。一次抗体Aの濃度をさらに上げて試してみましたが、あまり改善が見られません。 わかりづらい説明で恐縮ですが、他に必要な情報などありましたらご指摘ください。 どうぞよろしくお願いいたします。

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