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(無題) 削除/引用 No.4047-13 - 2015/05/06 (水) 15:20:14 - ああ 僕がいつも細胞をまく時には予めdishなりwellなりを濡らしてますね。 例えば6-well dishに撒く前に、適当量の培地を入れて表面を塗れさせて、その後、細胞の懸濁液を入れてます。問題ないですよ。おすすめです。

(無題) 削除/引用 No.4047-12 - 2015/04/30 (木) 09:25:11 - おお インキュベーターが振動してたりしないでしょうか。培地の量は前にもかいたような気がしますが2mlはほしいです。細胞が底に達してから均一になるように操作した方がいいと申し上げましたが、それでもうまくいかないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4047-11 - 2015/04/30 (木) 06:56:43 - mon クリーンベンチからインキュベーターへの移動中に偏る＝溶液が回転したか、波が出来た。＝＞真ん中に寄ったり、線状に偏ることが多いですね。 今回真ん中に細胞がいなくなるということなので、原因は対流なのかな。 対流だとすると底から急激に温まらないように、保温された培地を使い細胞液を分注した後、（溶液が回転しないように）dishをやや傾けてインキュベーターに移し、薄いペーパータオル（コピー用紙）なら3枚ほどあるいはキムタオルの上にそっと置くのが有効だと思います。プラスチックトレイ（100均等で購入可）に載せると、移動や複数枚の扱いも楽ですし、対流も防げます。タッパーだと移動時に歪むのが難。 ちなみに35mm dishに蒔く時には、培地量は2.5-3mL使っています（アッセイ時には減らす）。 96well dishに蒔く時には、200uL（通常の倍）ほど培地を使います（＋コピー用紙）。これで新人も綺麗に蒔けています。 また、60mm、10cm dishでもぐるぐる回すのはNGで、「縦に優しく1-2回揺らして波を起こしおさまったら横に1-2回揺らす」を2~4回繰り返すのが良いです（斜めに揺らすを入れてもよい）。

再度 削除/引用 No.4047-10 - 2015/04/29 (水) 18:48:51 - まい monさん、おおさん、追記の解答ありがとうございます。 きのに再度試して見ましたが、結果は同じく偏りました…。ただ、細胞懸濁液を必要量デッシュに入れて、インキュベーター外で静置した時は、細胞が綺麗に均一に播種出来ていたのを顕微鏡にて確認出来ました。が、インキュベーターに入れて、30分くらいして様子を見ると、先程とは全く違った、外縁に沿って偏って真ん中に細胞がほぼいないデッシュになってしまっていました。なので、インキュベーターに入れることによって、何かトラブルが起こっている可能性があると思われます。以前論文でインキュベーターに入れた時に対流が起こる、という文を見た記憶があります。対流の可能性もありますでしょうか？ また再度、細胞播種を35mm dishで行おうと考えています。何か他に気をつけたほうが良いこと、ありますでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4047-9 - 2015/04/27 (月) 21:29:14 - mon 私の方法は、35mm以下の小さいdishには、目的濃度に懸濁した細胞液をdishに加えます（dishの中ではかき混ぜない）。培地は保温しておく、液量も多めにします。 クリーンベンチ内で30分ほど静置し弱く接着した時点でインキュベーターに移す。 あるいは、細胞をいれたdishをやや傾けて、インキュベーターに移し、そっと静置します。クリーンベンチからインキュベーターへの移動中に溶液が回ると細胞が偏ります。その場合は縦・横に傾けて再懸濁し、そっと静置します。マルチウェルプレートの場合は（対流を防ぐため？？）綺麗な紙3枚の上に載せるたりプラスチックケースに入れたりして、金属棚から浮かせると良いですよ。

(無題) 削除/引用 No.4047-8 - 2015/04/27 (月) 20:52:40 - おお >[Re:7] まいさんは書きました : > 細胞懸濁液を新たな35mm dishに継代して静置する作業を、インキュベーター内ではなく、クリーンベンチ内で行っていたのですが、これも原因の一つになり得ますでしょうか。 細胞を均一にまくという視点ではクリーンベンチないで静置してもいいかと思いますが、pHの変化が細胞への負担になる可能性があります。 あと水平かどうかという観点もわすれずに。 改善されなかったということで、残念ですが、いずれの方法をとるにせよ、顕微鏡で確認しながら均一に分布していてそのまま培養して、偏りなく接着しそうかみながらやるといいです。そうすることで、自分の手癖というかそのなかでベストなやり方を見つけれるようになるとおもいますので。 因みにわたしは培地のはいったdishに濃い細胞のけんだく液を加えるより、希釈した細胞けんだく液を直接dishにくわえる方がやりやすいと思ってます。とくに3.5cm以下の場合。

(無題) 削除/引用 No.4047-7 - 2015/04/27 (月) 19:18:17 - まい 失礼します。 先日、細胞継代の際に発生する偏りの改善策として、おおさまが仰った策を実践してみたのですが改善ならずという結果になってしまいました。 細胞懸濁液を新たな35mm dishに継代して静置する作業を、インキュベーター内ではなく、クリーンベンチ内で行っていたのですが、これも原因の一つになり得ますでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4047-6 - 2015/04/23 (木) 22:46:15 - おお >[Re:5] まいさんは書きました : > ご説明ありがとうございます。 > おおさんのお話の中で、3〜4分静置とありますが、これは沈んでから揺らすとまた舞い上がって、再び沈むときに偏るということにはならないのでしょうか？ あまり舞い上がらないように揺らしてください。多少舞い上がったとしてdishの底の方に細胞があれば何とかなります。またdishを平行に揺らすよりも前後左右の方向に斜めに傾ける感じにするといいでしょう。 > ちなみに「沈む」の判断は顕微鏡で観察できるものなのでしょうか？(恥ずかしながらいままで混和してからそのままインキュベーターに入れていたので) わかります。底にフォーカスがあっているときどの程度の細胞がぼやけないで見えているかで判断がつくはずです。 たいていのかたは混和してインキュベーターに入れて終わりかもしれません。私が不器用なのかコツが分からないだけかもしれません。まぁ自分なりに工夫しているということで。。。 研究室のほかの人はどうしているかとかいろいろきいたりやっているのを見せてもらってもいいのではないでしょうか?隣の研究室の人でもいいですし。

(無題) 削除/引用 No.4047-5 - 2015/04/23 (木) 16:25:12 - まい ご説明ありがとうございます。 おおさんのお話の中で、3〜4分静置とありますが、これは沈んでから揺らすとまた舞い上がって、再び沈むときに偏るということにはならないのでしょうか？ ちなみに「沈む」の判断は顕微鏡で観察できるものなのでしょうか？(恥ずかしながらいままで混和してからそのままインキュベーターに入れていたので)

(無題) 削除/引用 No.4047-4 - 2015/04/23 (木) 15:11:12 - qw ＞35mmに培地を入れて細胞を播種 ここの操作方法に依存しそうなので、詳しく書くと、あなたの見落としている良い対処方法が見つかるかもしれません。 一般的に小さいディッシュやウェルだと、周辺部の方が液量が多くなるので、そのせいで、不均一になる可能性があります。そうだとすると、単に35mm-dishに加える培地量を増やせば良いかもしれません。私は普通35mm-dishに2mlの培地を使います。

(無題) 削除/引用 No.4047-3 - 2015/04/23 (木) 14:58:57 - おお あとちょっと裏技的なのでかこうかどうかとまどったんですが、 まずdishのなかで培地に均一なけんだく液にしたあと、dishを少し傾けてincubatorにいれます。2-3分後、反対方向に傾けてまた　２ー３分おきます。で最後にそこにたまっている細胞の偏りがあれば細胞がdishのそこから巻き上がらない程度にゆっくり左右前後にふります。

(無題) 削除/引用 No.4047-2 - 2015/04/23 (木) 14:34:15 - おお ぐるぐる回すよりは左右前後にふって均一にする方がいいです。 表面張力の影響で縁の培地の高さが中央より高くなっているので、縁の方のdish表面の細胞密度が高くなりがちです。培地を少し多めに入れるとそれはいくらか改善されると思います。3.5mm dishなので 2-2.5mlは入るのではとおもいます。 それで扱いにくいなら、6well plateを使ってもいいかもしれません。 また細胞が溶液全体に浮遊しているときに均一になってたぼうがいいに決まっているんですが、それが徐々に沈んでいく結果そう言うことが起こるので、いったんdishの培地に均一に細胞がけんだくされた状態になったら、3-4分ぐらい静置してください。底の方に細胞が沈んできてから、前後左右に振ってdishの底の方で均一にすればその後細胞はすぐに接着しますので不均一になるのを防げます。

培養細胞の継代にあたって 削除/引用 No.4047-1 - 2015/04/23 (木) 14:07:41 - まい 現在培養細胞を扱っており、その細胞を継代するときに細胞が偏るという現象に悩まされています。 60mm dishに継代する際は、細胞の偏りはあまり見られないのですが、35mm dishに継代した時、dishの外円に沿って細胞が偏り、中央の細胞数が極端に少なくなるという現象に見舞われています・・・。 35mmに培地を入れて細胞を播種した後、前後左右にやさしく混和して外壁に寄るのを防いでいるつもりなのですが、どうしても寄ってしまいます。(以前はグルグル dishを回して混合させていましたが、遠心力で余計に外壁に寄りやすくなると指摘を受けました) 細胞継代時に細胞の偏りを無くすには、あるいは軽減するために工夫したら良いことなどありますでしょうか？

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