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(無題) 削除/引用 No.4046-4 - 2015/04/23 (木) 10:01:33 - おお >[Re:3] jorさんは書きました : > おおさん、解説ありがとうございます。 > おおさんの仰る通りのシステムです。今後の実験では、目的遺伝子を過剰発現させた細胞をサンプルとして用いたいと考えております。その場合、デッシュにてDoxを添加させた培地で培養する事で目的遺伝子が発現すると思いますが、これを別のデッシュに継代してDox添加培地下で培養すれば同様の遺伝子発現状態を示す細胞を得られると考えてよろしいでしょうか？ onの状態で発現し続けるであろうと思われますが、ネガティブフィードバックなどもあるかもしれませんので、最初のonにして1、2日後の発現量が保証されるわけではないと思います。いちど確認してみるといいでしょう。 ずっと発現させたいならCMVとかのプロモーターで安定導入株つくればいいのかもしれないともおもえますが、、、同じ細胞でon offの状態がtet-on/offシステムでは見れるメリットはありますけど。 onの状態でかいつづけることは可能とおもいますが、発現した蛋白の間接的な影響も蓄積していくであろうということは気に留めておいた方がいいと思います。 > またどのくらい発現してるかをウエスタンブロットで確認したいと思ってるのですが、その場合はコントロール、Dox含有培地で培養した細胞を別のデッシュに継代してウエスタンブロットを行う手法でも問題ないでしょうか。 ネガティブコントロールをちゃんとおくということで、確認はできるとおもいますが、、、なぜこの系に不安があるのでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.4046-3 - 2015/04/23 (木) 09:31:44 - jor おおさん、解説ありがとうございます。 おおさんの仰る通りのシステムです。今後の実験では、目的遺伝子を過剰発現させた細胞をサンプルとして用いたいと考えております。その場合、デッシュにてDoxを添加させた培地で培養する事で目的遺伝子が発現すると思いますが、これを別のデッシュに継代してDox添加培地下で培養すれば同様の遺伝子発現状態を示す細胞を得られると考えてよろしいでしょうか？ またどのくらい発現してるかをウエスタンブロットで確認したいと思ってるのですが、その場合はコントロール、Dox含有培地で培養した細胞を別のデッシュに継代してウエスタンブロットを行う手法でも問題ないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4046-2 - 2015/04/22 (水) 22:53:32 - おお doxはdoxycyclineでtetracycline derivativeではないですか? tet inducible systemに必要なプラスミドがゲノムに安定にintegrateされているなら、tet/doxを培地に入れた状態でかい続ければ安定して発現を維持することができるようになってます。 ただし発現させる遺伝子がネガティブフィードバックで抑制されたり、増殖にふりであったりするとかいつづけると、発現に変動があることがあります。

Tet-onと安定発現株 (細胞取り扱い経験浅い) 削除/引用 No.4046-1 - 2015/04/22 (水) 21:31:05 - jor 現在ある遺伝子を過剰発現させることによって細胞に与える影響を調べるといった研究を卒業に向けて取り組んでいます。 そこで実験を始めるにあたって目的遺伝子の安定発現株取得に関して調べています。Doxを培養細胞の培地に添加すると目的遺伝子の発現が上昇するという状態の細胞を所有しているのですが、恐らくこの発現というのは一過性というもので細胞分裂が行われると徐々に発現が低下するものだと思います。 ですので持続的に発現する安定発現株？を得たいと考えています。安定発現株を取得する=Tet-on,offシステムを使用するというこのなのでしょうか？ また60mm dishもしくは35mm dishで目的遺伝子の安定発現株を取得することは可能なのでしょうか。その場合、培地中にDoxを添加して細胞培養をするかと思いますが、その後どのように操作すれば良いのでしょうか・・・。 ご教授いただければと思います。

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