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(無題) 削除/引用 No.4044-4 - 2015/04/23 (木) 09:44:57 - おお >[Re:1] はるさんは書きました : > ボスからはドキシサイクリンを培養培地に添加するだけで、目的遺伝子（今回私が高発現させたいもの）を高発現状態にすることができる。とお話ししてくださったのですが、どのタイミングでどれだけの時間、ドキシサイクリン環境下で細胞培養を行えばよいのかいまいちわかりません。 お持ちの細胞株、発現する蛋白、みたい現象で変わりますので、doxの濃度を振ってあなたの実験に好ましいとおもわれるdoxの量を決めてください。 dox濃度のレンジはクロンテックのTet-On® 3G Inducible Expression Systemでは10ng/mlだったかな。。。ぐらいになってますけど、あなたのお持ちのtet-systemのマニュアルなどをお読みになることをおすすめします。 時間もあなたの実験次第なので何ともいいようがありません > 細胞を継代するタイミングで新しいディッシュに培地・ドキシサイクリン・細胞を添加して培養する方法で実験を行うという解釈でよろしいのでしょうか。 それもあなたの実験によるので何ともいえません。発現させた蛋白がトリプシンなどではがした細胞の接着に影響するなら、たとえばdoxなしとの比較をするとき一つ余分なパラメーターを加えてしまうことになります。 > 恐らく今回の継代では３日後にコンフルエントになるように行う予定なので、継代のタイミングで培地にドキシサイクリンを添加して、３日後にウエスタンで遺伝子発現状態を確認ということになるかと思います。 ほんとに3日目がいいかは実験によるので、実験全体を考えて決めてください。発現を3日目にみて、何か実験のassayを2日目でやった方がいいので2日目にassayしたとなればちぐはぐですし。 > ちなみに、ドキシサイクリン環境下での培養時間ごとの発現状態を見たいとき、例えば１日後、２日後、３日後の発現条件を見たいときは、それぞれサンプルディッシュを用意しておいてウエスタンという実験も可能なのでしょうか。 可能です > 現在使用している細胞の倍加時間が３５時間程度なのですが、ドキシサイクリンを添加して１日後の発現確認が正確に確認できるものなのかも知りたいです。 正確ってよくわからないですが、なぜ不正確になると思いますか?きっちりやると再現性取れるデーターになるのでは? > 最後になりましたが、ドキシサイクリンを培地に添加する際、どれだけの量を添加すればよいという計算はどのように行うのでしょうか？ よほど特殊な状況でないと理屈から計算することはありません(なんグラムを溶媒に解かすとか、それを培地で何倍希釈するとか以外は)。濃度についてはすでに申し上げてますけど、たいてい手探りになると思います。

(無題) 削除/引用 No.4044-3 - 2015/04/22 (水) 19:37:06 - 独り言 なし、0.01, 0.1, 1, 10 ng/mlぐらいのドキシサイクリンを １、２、３日のタイムコースで振って、ウエスタンブロットで確認してみましょう。 ドキシサイクリンを入れるタイミングと、ケイダイのタイミングとかは基本的に気にしなくてもいいです。ケイダイ直後にいれても問題ないし、次の日に入れてもいいし。入れたままケイダイしてもいいし。入れっぱなしでもいいし。

(無題) 削除/引用 No.4044-2 - 2015/04/22 (水) 17:02:39 - a 場合によりけりです。 条件検討も実験のうちです。 少なくとも、ちゃんとボスと話し合いましょう。

抗生物質による遺伝子発現誘導 削除/引用 No.4044-1 - 2015/04/22 (水) 16:45:57 - はる こんにちは、現在目的遺伝子を抗生物質によって高発現状態にする実験を行おうと考えているのですが、方法をお聞きしたいです。 ボスからはドキシサイクリンを培養培地に添加するだけで、目的遺伝子（今回私が高発現させたいもの）を高発現状態にすることができる。とお話ししてくださったのですが、どのタイミングでどれだけの時間、ドキシサイクリン環境下で細胞培養を行えばよいのかいまいちわかりません。 細胞を継代するタイミングで新しいディッシュに培地・ドキシサイクリン・細胞を添加して培養する方法で実験を行うという解釈でよろしいのでしょうか。 恐らく今回の継代では３日後にコンフルエントになるように行う予定なので、継代のタイミングで培地にドキシサイクリンを添加して、３日後にウエスタンで遺伝子発現状態を確認ということになるかと思います。 ちなみに、ドキシサイクリン環境下での培養時間ごとの発現状態を見たいとき、例えば１日後、２日後、３日後の発現条件を見たいときは、それぞれサンプルディッシュを用意しておいてウエスタンという実験も可能なのでしょうか。現在使用している細胞の倍加時間が３５時間程度なのですが、ドキシサイクリンを添加して１日後の発現確認が正確に確認できるものなのかも知りたいです。 最後になりましたが、ドキシサイクリンを培地に添加する際、どれだけの量を添加すればよいという計算はどのように行うのでしょうか？

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