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(無題) 削除/引用 No.4041-22 - 2015/04/23 (木) 19:02:18 - F みなさん、大変有意義なアドバイスありがとうございました。 条件検討するにしても、方向性がすっきりしました。 まずは、抗体濃度を下げてふってみるのと、KD, Overexpressして免染したらどうなるか、みることにします。 いつもありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.4041-21 - 2015/04/22 (水) 21:09:38 - mon 「「可能なら（資金に余裕があるなら？）」」異なるエピトープを認識する抗体、あるいは同じエピトープでもクローン＝遺伝子が異なる抗体で同様の結果が得られると、信頼性が高まりますね（これでも偽陽性の可能性が限りなく０に近いと言うだけですが）。

(無題) 削除/引用 No.4041-20 - 2015/04/22 (水) 19:49:28 - mbb >[Re:19] みさんは書きました : > >[Re:18] mbbさんは書きました : > > > > 極論といえば、ノックダウンでもオフセット > > とかおこりうるため、確実にはいえないの > > ではないかと思ってるのですが、違うので > > しょうか？ > > > > オフターゲットのことですよね。 > 当然、オフターゲットでノックダウンしていないことを証明しつつです。 あ、ごめんなさい。うっかり間違ったこと書いてました。 しばらくRNAから離れてたとはいえ、お恥ずかしいです。

(無題) 削除/引用 No.4041-19 - 2015/04/22 (水) 18:02:51 - み >[Re:18] mbbさんは書きました : > > 極論といえば、ノックダウンでもオフセット > とかおこりうるため、確実にはいえないの > ではないかと思ってるのですが、違うので > しょうか？ > オフターゲットのことですよね。 当然、オフターゲットでノックダウンしていないことを証明しつつです。

(無題) 削除/引用 No.4041-18 - 2015/04/22 (水) 16:55:01 - mbb > > 極論、WBや免疫沈降で検出しているバンドと免染のシグナルが異なる場合があるのよね。 > 何度も意見が出てますがノックダウン後の免染とタグ付き外来蛋白の局在でしょう。 > 極論といえば、ノックダウンでもオフセット とかおこりうるため、確実にはいえないの ではないかと思ってるのですが、違うので しょうか？ 可能であれば局在しているオルガネラから 抽出精製して配列を読んでみるのが、わかり やすいのではないかと。 実際にはきれいにデータを出すのは難しいとも 思っています。

(無題) 削除/引用 No.4041-17 - 2015/04/22 (水) 12:46:44 - み >[Re:16] mbbさんは書きました : > N末端配列分析ができれば、やってみると > いいのではないでしょうか？ 極論、WBや免疫沈降で検出しているバンドと免染のシグナルが異なる場合があるのよね。 何度も意見が出てますがノックダウン後の免染とタグ付き外来蛋白の局在でしょう。

(無題) 削除/引用 No.4041-16 - 2015/04/22 (水) 12:38:38 - mbb N末端配列分析ができれば、やってみると いいのではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4041-15 - 2015/04/22 (水) 11:32:55 - 独り言 自作した抗体でWBしたら、目的のものが染まるけど、免染したら予想外に超きれいに中間系フィラメントが染まったことがあった。細胞質もしくはどこかのオルガネラにあると知られているタンパクだったし、GFP融合タンパク質との局在ともまったく違うし、中間系フィラメントで機能しているとは考えられないので、非特異だと結論。 なので、WBで使えても、免染でまったく違うものが染まることがあると思っている。たとえWBで非特異バンドが少なくとも、免染はタンパク質の構造が違うので非特異が少ないとは必ずしもならないし。 免染のシグナルがノックダウンで消えない限りは、本物のシグナルとは思えない。

(無題) 削除/引用 No.4041-14 - 2015/04/22 (水) 08:20:08 - L 私も、免染の抗体濃度を下げる方向で、何段階か振ってみると良いのではと思います。ウエスタンで陰性の細胞株をコントロールとして、核に隣接する染色が下がるところまで濃度を下げて、その条件で残るシグナルがあれば可能性が出てきますよね。その上でタグ付きの過剰発現で局在の再現性が取れれば、ある程度の結論にはたどり着けるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.4041-13 - 2015/04/22 (水) 07:48:26 - おお >[Re:10] Fさんは書きました : > みなさん、適格なアドバイスありがとうございます。 > 仰るように、overexpressしてタグでの染色との比較やKDしてどう変わるか、は次に検討しようと思っていた点でした。 > > ウェスタン・ブロッティングでは、露光時間によるのですが、長くエクスポーズすると、目的タンパク以外のバンドが複数（結構いっぱい）みえてきますが、バンドは薄いです。予想される位置に出てくるバンドはしっかりとしたものです。 > これら複数のクロスリアクト（私のコメントではノンスペ、など言葉の使い方がよろしくなかったですね、気づかせてくださいましてありがとうございました）するバンドが細胞免染で染まったとこに局在してて、足し算すれば、あの強いシグナルは、まぁ、納得はできるかもしれません。 ノンスペでなければwbでメインなバンドが目立って検出されているだろうという解釈もあるわけで、wbでmainなバンドの1/20のシグナルであれば、免染でも1/20程度だろうと思うとよく光っているところをちょうどよいシグナル強度にすればマイナーなシグナルは見えてないはず。 ただしWBと免染は違う系なのでWBでまったくノンすペがでないとしても免染で出ることもありうるので、経験、ほかのデーターの照らし合わせて矛盾があるなら、いろいろやりながら結論を得るのがいいかと思います。 あとWBの非常にマイナーなバンドが本当にノンスペなのか、というと誰も否定できないわけで、だからといってそのバンドを追って実験するのは場合によって大変労力がいるばあいもおおく、あまり突っ込まないところでもあるのかなぁとも思います。 免染の抗体の濃度も下げるとか検討されてなければやってみてもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4041-12 - 2015/04/22 (水) 07:33:49 - kk WBで発現していないと思われる細胞と実際の見たい細胞の染色像を比べたときに、強度の差はありますか？ 蛍光色素によって非特異的な染色像が見られる事もあるので、蛍光色素を変えるとかNaBH4で処理する方法もあります。 ちなみに、ノンスペは別に間違いではないと思います。 non-specific binding, recognition, interactionなどいろいろありますが、抗原ー抗体反応でも普通に使われますし。

(無題) 削除/引用 No.4041-11 - 2015/04/22 (水) 07:28:04 - F >[Re:8] Lさんは書きました : > ノックダウンで特異性を判断するので良いのではないでしょうか？　融合タンパクであってもその抗体が認識するエピトープを含んでいるのであれば、特異的結合により検出されているわけで、抗体そのものには問題ないように思います（得られたデータの解釈の問題）。 おっしゃるように、データ解釈の問題なんです。融合タンパクかどうかは、IPして、IPで使用した抗体のエピトープ配列とはだいぶ離れた別の領域を認識する抗体でIBするのがよいとは思うのですが、そのためだけに別の抗体をいろいろ試す（買う）のもどうなのかなぁ、という状態です。

(無題) 削除/引用 No.4041-10 - 2015/04/22 (水) 07:22:57 - F みなさん、適格なアドバイスありがとうございます。 仰るように、overexpressしてタグでの染色との比較やKDしてどう変わるか、は次に検討しようと思っていた点でした。 ウェスタン・ブロッティングでは、露光時間によるのですが、長くエクスポーズすると、目的タンパク以外のバンドが複数（結構いっぱい）みえてきますが、バンドは薄いです。予想される位置に出てくるバンドはしっかりとしたものです。 これら複数のクロスリアクト（私のコメントではノンスペ、など言葉の使い方がよろしくなかったですね、気づかせてくださいましてありがとうございました）するバンドが細胞免染で染まったとこに局在してて、足し算すれば、あの強いシグナルは、まぁ、納得はできるかもしれません。 条件検討、していこうとは思っているのですが、いろいろ検索しても、あまり代わり映えしないプロトコールばっかりで、うーむ、と思案してます。4%PFAで固定して、Tritonで穴あけて、免染っていうスタンダードな方法でやってます。 チャンバースライドにフィブロネクチンコートして細胞接着させているので、そこは通常の培養条件とは異なる点です。フィブロネクチンコートによって、そのタンパク発現が誘導されて、発現してない細胞株でもみえたのか、とか思ったり。。。←まぁ、ないですわね

(無題) 削除/引用 No.4041-9 - 2015/04/22 (水) 04:02:09 - おお 免染でもノックダウンで見てみればいいかと思います。もしタグ付きのconstructがあるのであればそれを発現した細胞でタグに対する抗体のイメージと比較してみてもいいかもしれません。KOなどされた細胞や組織があればそれはなおいいでしょう。 抗体の特異性については、最近はIPしてtop down MSで決めれるという話もありますが、それもどうかなとおもうこともあります。あくまでもIP条件下ということも問題かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4041-8 - 2015/04/22 (水) 03:33:24 - L ノックダウンで特異性を判断するので良いのではないでしょうか？　融合タンパクであってもその抗体が認識するエピトープを含んでいるのであれば、特異的結合により検出されているわけで、抗体そのものには問題ないように思います（得られたデータの解釈の問題）。 免染ではGolgiやTGNに局在するタンパクと交差反応しているような気がします。販売元に免染がダメな理由を聞いてみると良いかもしれません。ウエスタンでは目的のタンパクだけシングルバンドで検出されるのでしょうか？　もしそうなら、交差反応で検出されるタンパクは、変性によりその抗体と結合しなくなるのかもしれません。Nativeの状態でのみ交差反応するのであれば、IPしてCBBで見れば交差反応しているタンパクのバンドが見えるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4041-7 - 2015/04/22 (水) 03:23:39 - み >[Re:5] Fさんは書きました : > > でも、ノンスペでそんなにバチーンとある特定のオルガネラに局在しているような細胞免染像って得られてくるものなのかな、と疑問に感じてます。 連投で失礼。 ノンスペというか、他の蛋白へのクロスリアクトで強烈に染まる場合は幾らでも経験しています。 検討を要するって感じですね。

(無題) 削除/引用 No.4041-6 - 2015/04/22 (水) 03:16:57 - み >[Re:5] Fさんは書きました : > > かなり興奮したのですが、ウェスタン・ブロッティングでバンドが認められないがん細胞株でも、同様の染色増が得られてしまい、がっかりしているところです。 > >[Re:4] Fさんは書きました : > > 後者については、複数の異なるターゲット配列のsiRNAで目的タンパクをKDして、バンドの消失を確認しています。 > 現時点では、ｳｪｽﾀﾝには使用できるが、免疫染色のｼｸﾞﾅﾙは他の蛋白へのクロスリアクトの可能性が否定できない。 ｳｪｽﾀﾝでﾉｯｸﾀﾞｳﾝできている細胞での免疫染色では有為にｼｸﾞﾅﾙの減弱は観察されるか？ 強制発現蛋白の局在は検討しているか？ この辺のﾃﾞｰﾀをとれば整合性から判断できるよね。

(無題) 削除/引用 No.4041-5 - 2015/04/22 (水) 01:09:11 - F なぜ私がここまでparanoia的になっているかというと、ベクターさんの下記の便乗質問に関連します。 >[Re:3] ベクターさんは書きました : > 便乗してお聞きしたいのですが、免疫染色に使う抗体では皆様どうやって特異性を確認されておられますか? > で、先ほどまでにお話したように、ウェスタン・ブロッティングでは、非常に良好な抗体である感触がつかめてきました。添付マニュアルにはIP, IB用途しか記載がありませんでしたが、そのメーカーが検討してないだけだろうと勝手に判断して、それを使って、目的タンパクのがん細胞株での局在をみてみました。すると、ノンスペとは思えないようなイメジが得られてきました。具体的には、核に隣接するように染まってきました（Hoechestと2重染色すると目玉オヤジみたいな像）。 かなり興奮したのですが、ウェスタン・ブロッティングでバンドが認められないがん細胞株でも、同様の染色増が得られてしまい、がっかりしているところです。 でも、ノンスペでそんなにバチーンとある特定のオルガネラに局在しているような細胞免染像って得られてくるものなのかな、と疑問に感じてます。何か重大な見落としをしているのではないかと。 そんなこともあるさ、なんともいえないね、って結論になるとは思いますが。。。

(無題) 削除/引用 No.4041-4 - 2015/04/22 (水) 00:57:41 - F 真夜中にも関わらず、早速のお返事ありがとうございます。 >[Re:3] ベクターさんは書きました : > Western blotであれば、発現ベクターを入れた細胞で強い発現が見られればかなり安心できます。 > 目的タンパクをクローニングしてoverexpressしてみて、確認しました。結果は、ばっちりそこのバンドが強くなってました。しかしながら、このアプローチでは、endogenousのバンドは、たまたま同じくらいの分子量で異なるタンパクを認識していないことを示すことはできないのではないかと思ったり。。。そこまで気にする必要が一般的にあるとは思えないですけど。 >[Re:2] 774Rさんは書きました : > その抗体でIPして、他の抗体でWBして整合性を確認する。（逆の組み合わせも行う。） > > その対象タンパク質の量を増減するような操作をして、バンドの濃淡が理にかなっているか確認する。 前者の見方はまだやってません。後者については、複数の異なるターゲット配列のsiRNAで目的タンパクをKDして、バンドの消失を確認しています。 ただ、この場合は（同じ分子量にたまたまなっている）fusion proteinの可能性は排除できないのではないかとも感じてしまいました。 こちらも、可能性としては非常に低いでしょうけど。。。

(無題) 削除/引用 No.4041-3 - 2015/04/22 (水) 00:40:06 - ベクター Western blotであれば、発現ベクターを入れた細胞で強い発現が見られればかなり安心できます。 実際に、ラボで問題無しと思われていたA社の抗体では発現ベクターを入れた細胞でバンドの濃さが変わらなかったのが、B社の抗体ではきちんと濃さが上がったということがありました。以後、B社の抗体に乗り換えました。 便乗してお聞きしたいのですが、免疫染色に使う抗体では皆様どうやって特異性を確認されておられますか?

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