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G418によるLLCのセレクション トピック削除
No.4040-TOPIC - 2015/04/21 (火) 20:43:23 - ベーます

LLCのGFPステイブルをとるために、G418の濃度の検討を行っています。

一般的なプロトコールに従い、細胞を薄くまき、一週間くらい様子を見ているのですが、以下の点でうまくいきません。
どのように改善したらよいでしょうか。

1)細胞を薄くまくと(10%コンフルくらい)細胞が接着しない
2)一週間の途中でメディチェンをすると細胞がはがれてしまう
3)経日的な細胞死の評価ができない
4)継代をせず一週間かい続けるとコントロール群でも細胞がはがれてしまう

ご回答、アドバイスをお待ちしております。
 
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(無題) 削除/引用
No.4040-5 - 2015/04/23 (木) 23:23:09 - おお
そういえばLLCでなんかそんな使いづらい細胞があったような気がします。。。

G418によるLLCのセレクション 解決済み 削除/引用
No.4040-4 - 2015/04/22 (水) 16:29:54 - ベーます
おお様、mon様お返事ありがとうございます。

mon様にご指摘いただきました点は大変失礼いたしました。

以下、質問内容への補足をさせていただきます

1)、2)についてですが、この現象は通常時に細胞をメンテナンスしている際や薬剤不添加の状態でも確認されます。

3)のコントロール群とは薬剤を添加していないものです。


培地交換の際はシャーレの壁に伝わらせるようにして行っているのですが、細胞ははがれしまいます。今後、コラーゲンコートなどの検討も行ってみたいと思います。

(無題) 削除/引用
No.4040-3 - 2015/04/22 (水) 06:41:48 - mon
(3)経日的に剥がれる(死ぬ)というより、ある日数(G418の場合7-14日)で急に死に始め(剥がれ始め)てその後ぼろぼろになっていく感じです。最後までしぶとく剥がれない細胞(残骸?)も微量残りますが、増殖することは無いと思います。死に始めるまで日数がかかるので植え次ぐ場合もあります。
細胞が剥がれやすい場合、培地を壁面から優しく添加すると良いでしょう。ポリリジンやPEIコート、コラーゲンコートで接着性を増して、アッセイすることも可能です。剥がれた細胞を遠心で回収してディッシュに戻し、それで接着しないなら薬剤の効果(細胞が死につつある)が出ていると判断出来ます。あとは一般的な注意事項で、細胞は対数増殖期の活きの良い状態で継代し、トリプシン処理はできるだけ短時間で済ます等でしょうか。
おおさんの指摘とかぶりますが、そのコントロール群でも、(1)(2)の現象は観察されますか?観察されないとすると、薬剤の効果ですよね。
なお、コントロール群=薬剤不添加ですよね?
「メディチェン」って、メディウムチェンジ=培地交換の意味ですよね。
不特定多数の方が閲覧する掲示板では、ラボスラングは使わない、コントロール群などの対象・処理を明確に記載してください。(ネガティブ)コントロール群として、薬剤・溶媒不添加、溶媒だけ添加の2種考えられることもありますので。

(無題) 削除/引用
No.4040-2 - 2015/04/21 (火) 21:02:08 - おお
トランスフェクションしたあと、GFPの蛍光が検出できますか?できないなら効率が悪いかもしれません。効率の改善をした方がいいですが、薬剤マーカー存在かでかいつづけると、少ないですがぽじのクローンが出現することがあります。


>[Re:1] ベーますさんは書きました :

>
> 1)細胞を薄くまくと(10%コンフルくらい)細胞が接着しない
> 2)一週間の途中でメディチェンをすると細胞がはがれてしまう

どの時点でまいたのかとか状況がわかりませんが、セレクションがかかってるからでは?

> 3)経日的な細胞死の評価ができない

通常安定導入株をつくるのにそう言う評価はしませんけど、、、なにか実験でその様なプロトコールを考えているのでしょうか?

> 4)継代をせず一週間かい続けるとコントロール群でも細胞がはがれてしまう
>

コントロールはなんですか。空とかGFPの発現ベクターでしょうか?薬剤でセレクションがかかるならはがれてきてもおかしくないですが、、、それともコンフルになって細胞が調子悪くなってはがれるんでしょうか。

細胞によっては薬剤で調子悪くなった細胞がごぞっとはがれたりはしますけど。

G418によるLLCのセレクション 削除/引用
No.4040-1 - 2015/04/21 (火) 20:43:23 - ベーます

LLCのGFPステイブルをとるために、G418の濃度の検討を行っています。

一般的なプロトコールに従い、細胞を薄くまき、一週間くらい様子を見ているのですが、以下の点でうまくいきません。
どのように改善したらよいでしょうか。

1)細胞を薄くまくと(10%コンフルくらい)細胞が接着しない
2)一週間の途中でメディチェンをすると細胞がはがれてしまう
3)経日的な細胞死の評価ができない
4)継代をせず一週間かい続けるとコントロール群でも細胞がはがれてしまう

ご回答、アドバイスをお待ちしております。

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