全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.4016-11 - 2015/04/16 (木) 11:33:45 - こまりはてた 皆さん　ありがとうございます。 　クロロホルムは最近、作業環境測定が義務付けられたので、私だけが使用するために測定にかかる費用を節約したいそうです。フェノールそのものは、数十年前のものかもしれない缶入りのものを使えと言われたので、恐ろしくて使っていません。そのうち、フェノールも使うなと言われそうなので、自作バッファーの方も考えていきます。

(無題) 削除/引用 No.4016-10 - 2015/04/16 (木) 10:26:33 - おお ところで特定化学物質第3類のフェノールはそちらのラボで使ってもいいのですか?クロロフォルムでなく水を加えるタイプであっても、試薬にフェノールがはいってますので、、、

(無題) 削除/引用 No.4016-9 - 2015/04/16 (木) 10:00:03 - 名無し キアゲンなどでBufferだけでも買えるから、似たような組成の市販Bufferを探す方が良いかと思います。

クロロホルムフリー 削除/引用 No.4016-8 - 2015/04/16 (木) 08:53:46 - s isogen2 がおすすめです。クロロホルムフリーですが、組織サンプルでも即時変成され、とても分解が少ないtotal RNAが取れています。

(無題) 削除/引用 No.4016-7 - 2015/04/15 (水) 21:19:58 - こまりはてた ＞おおさん 　ありがとうございます。 　バンドの位置からしてgDNAがほとんどです。 　すべて自作するか、APさんが教えてくださった方法を検討するかやってみます。

(無題) 削除/引用 No.4016-6 - 2015/04/15 (水) 20:27:50 - おお いろいろなキットのバッファーなどをまぜこぜで使うよりは、組成がわかっているキットにあわせてそのバッファーを自作する方がいいとおもいます。DNA用のキットの溶液などはRNAを除くようにできているので対象外です。

(無題) 削除/引用 No.4016-5 - 2015/04/15 (水) 20:22:42 - おお なんとなくゲノムのDNAが取れているようにかんじます。

(無題) 削除/引用 No.4016-4 - 2015/04/15 (水) 20:03:32 - こまりはてた >ふ〜さん 　　困った質問ですみません。ほんとはぼやくつもりはなかったのですが、結局ついでにぼやきますが、他のメンバーはボスが決めたプロトコールを盲目的に信じて実験しています。データが毎回安定していないところからして、おそらくみんな実際は日常的にうまくいっていないのですが、過去の経験上、おかしいことを伝えても学術的に理解してもらえないので、自分だけはまともに実験しようと一人で苦戦しているところです。 >APさん 　　ありがとうございます。早速、過去のトピを参考に考えてみます。

(無題) 削除/引用 No.4016-3 - 2015/04/15 (水) 19:35:35 - AP 別のキットの、しかもプラスミド用の、バッファーでうまくいくとは思えません。似た組成でも、それぞれ最適化が異なるので、やめたほうがいいです。本来RNA精製用のカラムシステムは、RNAを担体に吸着させた状態でDNAを洗い流すように条件設定されているんですから、逆にプラスミドを吸着精製するシステムの洗浄バッファーを使うって、思い切ったことしますね。 先日、トピに取り上げたのですが、Trizolのような従来の液相分離タイプの後続型で、上清と沈殿に分離するタイプのRNAzolやIsogen 2といった製品が出てきています。まだ使ったことはないのですが、不純物が沈殿として分離できるので、従来タイプよりDNAのコンタミが格段に低いようです。成分は従来タイプと大きな違いはないようですが、クロロフォルムを入れるのではなく水を入れるところがミソです。加水の条件さえ最適化すればTrizolを使っても同じことができるんじゃないかと、私は思っています。 DNaseが必要かカラム精製が必要かは、とったRNAでどんな実験するかによります。DNase処理は必須のものではなく、RNAにもダメージを与えうるし、ダウンストリームに持ち込みたくない成分が加わるので、不必要なときはむしろやらないほうがいいくらいです。TrizolだってDNAとRNAの差次的抽出によってDNAはかなり除けます。不十分だったら、一旦精製したRNAに対して、再度Trizol精製をかけるんだっていいと思います。 DNase処理など、さらなるDNA除去が必須でないシチュエーションとしては、たとえばRT-PCRのときに ・標的RNAの発現量が十分に高く、コピー数が残存しているゲノムDNAを桁違いに上回っていれば、ゲノム由来のPCR産物は無視できる程度かもしれない。それはRTを省いたコントロールをとってみれば検証可能。 ・ゲノム上でイントロンをまたぐようなPCRならRNA由来のPCR産物とDNA由来のそれが区別できる。区別さえ出来れば、問題ない実験もある。また、イントロンの分、長くなった鋳型は、イントロンのないcDNAを鋳型にしたものと競合したとき、増えが悪いとか、検出できるレベルまで増えてこないとかで、問題にならないかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.4016-2 - 2015/04/15 (水) 17:33:55 - ふ〜 日常的に行われているのなら上手くいく方法は既にラボ内に確立されているのでは？ その方法でやれば良い。 色々とキットを使い回しているようですが、通常の方法でやらず上手く行かないとぼやかれてもね。

RNA抽出について 削除/引用 No.4016-1 - 2015/04/15 (水) 16:32:34 - こまりはてた 現在所属のラボで日常的に行われているRNA抽出について、どの部分を改善すべきか困り果てているのでよろしくお願いします。 　RNA抽出の際に、昔の使い残しのTAKARAのFirstPure kit のバッファーで細胞のlysisからカラムにかける直前までの処理を行い、その後、別購入のカラム(FAVORGEN社 farbカラム）に通し、GeneElute Plasmid purification kit (Sigma)のWash Bufferでwashし、FirstPure kit 付属のelution bufferで抽出を行っています。 　しかし、私が試したところ、A260/280はそれらしい値(1.9~2.0)に計測できるのですが、泳動するとrRNAの二本のバンドは一切見えず、高分子量のところに一本鎖のバンドが見えるだけでした。 　無理を言ってTRizol、クロロホルムを購入してもらい、これらを使って精製したRNAをもう一度上の操作をして使用していたのですが、クロロホルムが特定化学物質に指定されたのを受け、ラボで徐々に使用しない方針にするらしく途方に暮れています。 　ほかのキットやDNAseは購入してもらえそうにありません。 　使用しているbuffer類を改善するしかないのですが、もっとも怪しい、wash bufferを検討しようかと思っていますが、公開されている組成を見る限り（ｐH7.5 Tris-HCL + 塩類　+　Etanol）、DNAの混入を防げそうには思えません。 　 　変な質問で申し訳ありませんが、どうぞよろしくお願いします。

全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---