Bio Technical フォーラム

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電気泳動の結果に関して (かなりの実験初心者です><) トピック削除
No.4013-TOPIC - 2015/04/14 (火) 22:20:45 - 不思議なナージャ
先日SDS-PAGEにて細胞から抽出したタンパク質サンプルを同じタンパク質量で5ウェル分アプライ・泳動したところ、バンドの横幅幅といいますか大きさが不均一という結果になりました。本来であれば、同じサンプル組成なのでバンドの横幅もほぼ均一に出るんじゃないかと思っていたのですが、バンドの偏りっていうのか・・・ウェルの片側にサンプルが偏ったまま泳動されました!という形状のバンドや、やたらと縦長のバンドなど形状がさまざまなバンドが検出されました。

これは、ゲル作製時にゲルが歪んでいた、もしくはサンプル調製時の問題でしょうか。
 
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No.4013-7 - 2015/04/15 (水) 05:44:40 - おお
DNAがあると超音波やニードルをつかったりして調整しないと、ねばねばとしてたりして均一にサンプルが取れてないかもしれない。

同じ蛋白量でもサンプルが違えばバンドもいろいろだと思うけど、、、特に違う組織とかなら蛋白定量も組織成分によってぶれる可能性もあるし。。。

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No.4013-6 - 2015/04/15 (水) 04:30:59 - じぇる
バンドの形状というのはウエスタンで確認したのですか?泳導後ゲルを染色して確認したのですか?

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No.4013-5 - 2015/04/15 (水) 00:29:12 - 名無し
たぶん、そのときに分子量マーカーも泳動してるとおもうんだが、それの分離パタンはどんな感じかな。それも変な感じならゲルがマズいとおもうし、それは一応ちゃんと分離できてれば、サンプル自体に原因があるとおもう。でも、とりあえずは、SDS-sample bufferとかの試薬に間違いはないかは確認したほうがいいとおもう。また、泳動完了に要する時間とか発熱とか電圧あるいは電流値(どっちか定値とおもうので、どちらか)とかがいつもと比べてなんか違ってたみたいなことはないかな。ゲル作成や泳動buffer作成とかの試薬取り違えたりするとこの辺が変わってくるかもしれない。

ちょっと書いてる内容が十分に把握できないとこあるんだが、バンドの幅っていうのは、レーン間のバンドの幅が違う(真ん中のほうのレーンが細くて端のレーンが幅が広いみたいな)とかそういうことかな。それとも一つのレーンの中に細い部分と太い部分がある(くびれたような感じ)ということかな。
前者だともし一番端のレーンの横に何も流してないなら拡散によるものかな。後者はサンプルの蛋白質組成がかなり偏っていて特定の蛋白質が大量に含まれるようなものを多めにアプライして泳動したときにおきることある(血清蛋白質などを多めにアプライした時などにそういう経験ある。)

また、縦長のバンドって、シャープなバンドにならずに縦方向にスメアになるということかな、それともバンド自体が太いということかな。その辺のことがわかるともう少し原因が絞れるかもしれない。前者なら十分に剪断できてない長いままのDNAをたくさん含むサンプルを泳動するとなるし、脂質や糖とかを沢山含むサンプルでも起こるらしい(植物由来の試料とかでそういうのあるって聞いた。自分では経験ないので詳細は不明だけど)。後者だとアプライした蛋白質量大杉ということかもしれない。

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No.4013-4 - 2015/04/14 (火) 23:07:03 - おお
たしかにげるもあやしいですね。あとオーバーロードもあるかも。
DNAとか混入、サンプルの濃度が濃すぎるなどするとwellに均一に流し込むのが難しくなります。

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No.4013-3 - 2015/04/14 (火) 22:49:57 - cc
DNAの混入かな

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No.4013-2 - 2015/04/14 (火) 22:44:05 - ふ〜
プレステインマーカーをゲルの端のレーンや中央のレーンにながして何が悪いか解決すべき。
トラブルシューティングが自分でできない人は実験には不向きかと。
まあ一事が万事で実験だけではないかもしれないけどな。

電気泳動の結果に関して (かなりの実験初心者です><) 削除/引用
No.4013-1 - 2015/04/14 (火) 22:20:45 - 不思議なナージャ
先日SDS-PAGEにて細胞から抽出したタンパク質サンプルを同じタンパク質量で5ウェル分アプライ・泳動したところ、バンドの横幅幅といいますか大きさが不均一という結果になりました。本来であれば、同じサンプル組成なのでバンドの横幅もほぼ均一に出るんじゃないかと思っていたのですが、バンドの偏りっていうのか・・・ウェルの片側にサンプルが偏ったまま泳動されました!という形状のバンドや、やたらと縦長のバンドなど形状がさまざまなバンドが検出されました。

これは、ゲル作製時にゲルが歪んでいた、もしくはサンプル調製時の問題でしょうか。

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