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(無題) 削除/引用 No.4009-5 - 2015/04/14 (火) 23:28:19 - おお 転写因子Xを発現させた時点で、発現させてない細胞とは別物でベースラインがいくらか動いてもおかしくないということも考慮するといいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.4009-4 - 2015/04/14 (火) 23:24:13 - おお >どうしてもA=Bになりきらず（A/B＝1.5どまり） この辺はその実験系の限界もあるでしょうし、1.5倍に意味を見いだすのは難しいかもしれません。ぎゃくに5倍あったのが1.5倍までさがったのだから、その部分に関してはエンハンサーの活性が明瞭なのでまずそちらの方に通常着目するとおもいます。 かりに1.5倍実際の細胞でmRNAや蛋白量が上がっていたとして、その蛋白の影響が細胞に現れるかという視点でも、5倍上がった方がインパクトがあるわけですから。もちろん1.5倍を完全に否定するわけではありませんが。 どうしてもというんであればプロモーター(転写開始位置より下流)をいじってみてください。そう言うところにもエンハンサーがある例があります。

おお様ありがとうございます。 削除/引用 No.4009-3 - 2015/04/14 (火) 18:08:55 - 大学院生です 大学院生です。 おお様、いつも色々と丁寧にご指導下さりありがとうございます。 以前Q5site directed mutagenesis kitについて質問させて頂いた時も、おお様を初め皆様よりご指導頂き、その後さくさくと変異ベクターを作成する事ができました。（今では試薬の量を半分位まで節約しても問題なく作れるようになりました） 現在2カ所に対し変異をいれた変異ベクターで、Firefly/Renilla-Lucがかなり低下するのを確認はしたものの、どうしてもA=Bになりきらず（A/B＝1.5どまり）、他の潰すべき配列を探さねばならないのかどうしようか考えあぐねておりました。 考えが煮詰まってきて、a=b（こちらもやはりa/b=1.5どまり）にもならないし、そもそもの仮説が間違っているのではないかと不安になってきたところでした。 教えて頂いた事を参考に、もう少し検証作業を続けて参ります。 もし他にご意見のある方がいらっしゃいましたら、是非ともお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.4009-2 - 2015/04/13 (月) 19:40:35 - おお Renillaが低いのが気になりますね。特にPGL410<luc>basicで。 １）そもそも、a=bであるべき じゃっかん何らかの影響をうけることはあるかもしれません。低い値で多少差があるのはそんなに問題にならないと思います。 ２）結果をグラフ a, b, A, B全部乗せるといいかと思います。バックグランドがどれくらいでそれに対してどれくらいのシグナルが得られたのかがわかるからです。 BのコントロールはAでもあり、bでもありますから、コントロールとテストを両方提示することは大事かと思います。

デュアルルシフェラーゼアッセイの結果の解釈について 削除/引用 No.4009-1 - 2015/04/13 (月) 18:59:44 - 大学院生です 大学院生です。平素より大変お世話になっております。 プロメガのデュアルルシフェラーゼアッセイキットを用いた、deletion assayやmutaition assay の結果の解釈についてご教示の程お願い申し上げます。こちらの旧フォーラムにも同様のトピック（20100403の「恐縮です」さんのたてたトピックです）を拝見致しましたが、それでも分からないところがあり、類似の質問となりましたが、トピックを挙げさせて頂きました。 現在、ある転写因子Xが、Yという遺伝子のプロモーター領域に結合しているのかどうかについて調べています。転写因子Xの強制発現の為のベクターを仮にαベクター、そのmockをβベクターとします。 実際の実験の状況としましては、以下の通りです。 PGL410<luc>basic + αのFirefly-luc値をpRLTKによるRenilla-lucで補正した値を a とします。 同様に PGL410<luc>basic + βの時のFirefly/Renilla-luc の値を bとします。 a/bが常に1.5倍〜2倍位になります。（Fireflyの値もRenillaの値も3桁以下の小さい値なのですが） 一方、関心プロモーター領域Y（転写開始点上流1000bp位から下流150bp位まで）をインサートして作成したレポーターベクターについても、同様にRenilla-lucで補正した値を、 pGL410::Y + α→A pGL410::Y + β→B と致します。 プロモーター領域がある程度の長さまではA/B=4-5倍になるのですが、転写開始点ぎりぎりまでプロモーター領域を削っていくと、A/Bが1.5倍〜2倍位に下げ止まってしまいます。（この場合、ルミノメーターでの具体的な数値はFireflyが5-6桁位、Renillaが4桁位になるのですが）その後は、結合予測配列にあちこち変異を入れても、A/B＝1.5倍どまりです。 ＜質問＞ １）そもそも、a=bであるべきと思うのですが、そのような値にならないのはどこに問題があるのでしょうか？ ２）結果をグラフにする時の一般的な考え方は、 （A-a）／（B-b）とすべきなのでしょうか？それともA-B?それともA/Bとすべきなのでしょうか？ ごちゃごちゃとした長文での質問となり申し訳ございません。 何卒宜しくお願い申し上げます。

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