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(無題) 削除/引用 No.3996-17 - 2015/04/10 (金) 22:05:53 - 通りすがり ぱっと思ったのは 1. OD値と生成物量に線形な関係がない 2. 前定常状態 3. 生成物による活性化 「開始直後から"直線的に"進まず」っていう部分は前定常状態っぽいですが、5分とか20分って長すぎるような。。。あとよく分からないのは「ATPに対するKmを求める際に反応の遅れがあり」の部分で、ATP以外のKmを求める際には反応の遅れがないの?

(無題) 削除/引用 No.3996-16 - 2015/04/10 (金) 09:32:20 - おお monさんのしてきに関係するんですが、まず一体何を見たいのか、なんのための実験なのか再確認した方がいいかとおもいます。 その酵素の特性であるなら立ち上がりが緩やかなのに意味があるかもしれませんし、細胞内で活性化したときのパラメーターがみたいのであれば、(立ち上がりの緩やかなところが何に依存するものかある程度追求が必要かもしれませんが)、立ち上がって直線的になったところを見る手はあるかもしれません。 まずは得られた事象を分析するところからはじめるのが大事だと思います。

(無題) 削除/引用 No.3996-15 - 2015/04/10 (金) 07:54:06 - mon 反応系の議論は皆様にお任せしますが、そもそも論的に「初速」のどちらかを選ぶことに固執していますが、二つあってはダメな理由は？ どちらか（初期反応かな）が実験上のアーティファクトと考えているのでしょうか？ しっかりとした再現性があるなら、表にする場合などは括弧付き等で表記すれば良いのでは？ 例えば、レセプターとリガンドの関係も、レセプターの高次構造の違いで、低親和性型、高親和性型と二つになるものもあります。 強いて言えば、他との比較時でしょうか。 その場合は、ご自分で安定な？最終的？生理的に意味のある？「反応が直線的になる」所と、定義すれば良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.3996-14 - 2015/04/10 (金) 07:02:32 - おお >他の酵素ではそのような現象は見られていないので、検出限界の問題ではないと思っています。 いや、その緩やかな部分がつかった検出系でちゃんと検出できる範囲なのかがもんだいになってるんじゃないですか?

ありがとうございます 削除/引用 No.3996-13 - 2015/04/10 (金) 05:27:35 - タナ まとめてのお礼になり申し訳ないですが、皆様ありがとうございます。 片対数ではなく、横軸を時間、縦軸をOD値でとっています。 その傾きから初速度を出したいのですが、反応開始初期と後期で傾きが異なるため、どちらが本来の初速度なのかと思っています。 反応はEDTAで止めています。 他の酵素ではそのような現象は見られていないので、検出限界の問題ではないと思っています。 cDNAさんのおっしゃる反応開始時の温度とおおさんのおっしゃる自己リン酸化が関係しているように思います。 反応開始時の温度が問題の場合、インキュベーションで解決するかと思いますが、自己リン酸化の場合、反応が直線的になる後半部分を初速とすべきでしょうか？ それとも、酵素自体の改善（あらかじめリン酸化しておくなど）で反応初期から直線的になるようにすべきでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3996-12 - 2015/04/09 (木) 14:04:08 - おお ああ、そうだなぁ。反応をどうやっててめているかもきになるなぁ。

(無題) 削除/引用 No.3996-11 - 2015/04/09 (木) 13:29:06 - cDNA 反応速度を求めるのに、吸光度の時間変化測定をしているような印象を受ける最初の質問ですが、やっていることはELISAなので、反応時間一点がグラフの一点になって、反応時間が違う別の実験を複数行うことでタイムコースをとっている訳ですよね？一つのキュベットやウェルで時間変化を追っている訳ではないですよね？ ある時間反応させたときに蓄積した生成物をELISAで定量している、という理解でいいでしょうか？ Tyrosine kinase とELISAで調べると幾つかキットの情報が出てきますが、反応時間は長ければ数時間に及ぶようです。説明書をよく読んでみてください。 また、測定系を聞かれて「ELISA」とだけ答えていては、そこでどんな反応が起きているのか深く考えずに答えだけが欲しいという印象を受けてしまいます。一般的なプロトコールに従うべきかを検討している実験に見えますので、新たなアッセイ系を作るぐらいのつもりで考え、そのうえで質問しないと、ドンピシャの実験をしている人以外からは勘違いに基づいたアドバイスしか返ってきませんよ。 反応の初期で活性が低く見えるのは、既に指摘があるように検出限界との兼ね合いである場合が多く、他には、反応のスタート時の温度が例えば氷上に置いてある酵素溶液を温度に影響が出るほど混ぜるなどして反応温度が低い場合などにの見られます。

(無題) 削除/引用 No.3996-10 - 2015/04/09 (木) 11:54:05 - サンショウウオ まずは、どんな反応経路なのかが気になります。

(無題) 削除/引用 No.3996-9 - 2015/04/09 (木) 11:45:23 - サンショウウオ 　おおさんも指摘されていることに関連して 　チロシンキナーゼによる基質のリン酸化反応のどこかに、何らかのポジティブフィードバックが存在した場合、ミカエリスメンテンの式で想定している反応と異なってきます。 　 　その場合、ミカエリスメンテン型の反応ではないので、ミカエリスメンテンの式で回帰曲線引いてKmを算出することは無理です。 　新たに自分でモデル（微分方程式）たててソフトで計算させるか手動で微分方程式を解く（手動で解ける線形方程式ならいいけど。。。）とかになるんじゃないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.3996-8 - 2015/04/09 (木) 08:17:31 - おお >[Re:7] yyyさんは書きました : > 反応産物の検出限界の問題、ってヲチではないんですよね？ > > つまり、反応開始直後は反応は普通に進んでるけど、産物の検出系の感度が低くて正確に検出できてない、とかは否定されてるんでしょうか？ わたしもそれはきになっているんですが。。。

(無題) 削除/引用 No.3996-7 - 2015/04/09 (木) 08:05:03 - yyy 反応産物の検出限界の問題、ってヲチではないんですよね？ つまり、反応開始直後は反応は普通に進んでるけど、産物の検出系の感度が低くて正確に検出できてない、とかは否定されてるんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3996-6 - 2015/04/09 (木) 05:47:25 - おお ん、片対数でグラフかいてるのか? それならどこで計算しても同じ数字が出るというオチ?

(無題) 削除/引用 No.3996-5 - 2015/04/09 (木) 05:44:22 - おお なんだ、面白いじゃないですか。自己リン酸かとか直接あるいは間接的にポジティブフィードバックがかかってないかなぁとおもいました。 何かモデルに当てはめるか、二相性があるとして、両方で数字を出してみてもいいかもしれません。 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000414001698

(無題) 削除/引用 No.3996-4 - 2015/04/08 (水) 23:49:30 - タナ また言葉足らずですみませんでした。 チロシンキナーゼの基質リン酸化をELISAで基質の抗リン酸化抗体で検出しています。 この系でATPに対するKmを求める際に反応の遅れがあり、初速をどこで取ったらいいか疑問に思っています。 先の質問でeeさんがおっしゃっていたように、反応が早いものは遅れが見えていないだけで、遅くから立ち上がってくるものに関しては、初速としては遅い開始ですが、反応が伸びてきたところで初速をとるべきかと思っているのですが、いかがでしょうか？ それとも、そのような反応を示す酵素は、充分に活性化されていない状態であり、問題となるのでしょうか？ よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.3996-2 - 2015/04/08 (水) 21:40:35 - cDNA 反応測定には複数の酵素反応の連鎖反応でモニターしていませんか？ その場合、後半の酵素、基質の濃度が低いとそんなことも起こります。 このような事全部含めて、まずはどんな測定系であるのか、詳細が書かれていなければいいアドバイスは受けられません。掲示板ですので特にそうです。

Kmについて（酵素反応） 削除/引用 No.3996-1 - 2015/04/08 (水) 21:19:14 - タナ 酵素反応で、ATPに対するKmを求めているのですが、 反応が開始直後から直線的に進まず、5分とか20分たってから伸び始めるような場合、 その直線的になったところの傾きで初速度を求めるので問題ないのでしょうか? 言葉通りの初速度とすれば、反応の遅い最初の5分などのところでとるべきかと思いますが、その酵素本来の初速度としては、反応が直線的になるところ（今回の場合20分以降）でとるべきかと思っています。 どちらを初速度とするのが正解でしょうか？ よろしくお願い致します。

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