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酵素反応について トピック削除
No.3992-TOPIC - 2015/04/08 (水) 07:29:17 - タナ
酵素反応で濃度依存性を見る際に、反応が直線的に進んでいくことが一般的かと思うのですが、今回実験した系では反応がシグモイドになります(横軸を対数にして)。

系を比較する場合、直線的に反応するほうが、酵素濃度と活性が比例していてわかりやすいように思うのですが、シグモイドでも問題ないのでしょうか?
シグモイドの直線領域となると、濃度範囲が狭くなるように思います。

同じ酵素、基質を使用した場合、検出系の違いでシグモイドになる系と直線の系、どちらが良いのでしょうか?

また、本来直線的に進むと期待される系で反応の立ち上がりが少し遅く、シグモイドになっている場合、何が起きているのでしょうか?それでも問題はないのでしょうか?そういった反応を示す酵素なのか、酵素に問題があってシグモイドになっているのかの判別がつかず困っています。

いくつも疑問があって分かりにくいかと思いますが、何かアドバイスいただけるとたすかります。よろしくお願いします。
 
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ありがとうございます 削除/引用
No.3992-13 - 2015/04/10 (金) 05:06:22 - タナ
まとめてのお礼になってしまい申し訳ないですが、皆様お答えいただきありがとうございます。
聞きたいことをわーと書いてしまい、分かりにくかったと思います。改めて見ますと、自分でも勘違いを起こす聞き方だったと思っています。

後半部分の質問で立ち上がりが遅れると書いていたのは、横軸は対数ではなく、実数です。
papaさんのお答えが聞きたかったことのお答えに思います。
プレインキュベーションなどに気をつけてやってみたいと思います。
Aの場合で、酵素濃度を変えてもそのような反応は見られていますが、酵素濃度が高い方が立ち上がりが遅れる傾向は少ないので、見えているかいないかの差なのかと思っています。

前半部分の質問はまた別の質問で、違う反応系(検出系)どうしで比較する場合(酵素反応までは同じでその後の検出の仕方が、抗体でみるか検出用の酵素反応で見るかの違い)、直線的にグラフを書ける系とシグモイドで書ける系では、どちらが望ましいかということを聞きたかったのです。
系の感度やばらつきなど総合的に判断ななるかと思うのですが、見た目では直線的な方が直感的に分かって好ましいかと思っています。
酵素量が倍になれば活性も倍といったように。
シグモイドだと、グラフを書いたり式を求めて酵素量を算出するのが大変に思ったため、シグモイドの系の利点はあるのか?と思ったのです。
どちらの系が良いかは、そういう直感的に楽かどうかではなく、総合的な判断になるのかなと思っていますが、直線で見られるなら、そちらの方がいいのでは?などの意見があるのかなと思って質問させていただいた次第です。

皆様のお答えを参考に、もう一度反応原理や生化学の勉強を含めて勉強してみます。

(無題) 削除/引用
No.3992-12 - 2015/04/10 (金) 00:08:58 - yyy
確かに、その2つを質問主さんは念頭に置いてるのかも知れませんね。そう考えると、これまでのレスの内容もより理解し易い気がします。

酵素濃度を横軸に取ってるのに、「反応の立ち上がり」と時間との関係の議論が出てきたり、片対数のグラフの情報しか出されてない、とかイマイチ質問主さんの持ってるデータを描くことが出来ず、議論が噛み合ってない気がしてました。

もっとも、自分が質問とこれまでの議論の流れをよく読んでなかったというせいもありますが。

(無題) 削除/引用
No.3992-11 - 2015/04/09 (木) 17:59:42 - papa
@横軸:酵素濃度(対数),縦軸:活性のシグモイドとA横軸:時間,縦軸:活性のシグモイドの2つを議論しているということなのでしょうか。

@の場合:
酵素低濃度では基質減少が少なすぎて差が出ずらく,酵素高濃度では基質が減少し過ぎていて活性の差がでていないのではないでしょうか。結論としては,直線性がなりたつ酵素濃度で反応系を組む必要があります。単純な酵素反応なら,酵素量が倍なら活性が倍になる条件が大切だと思います。

基質の減少を追って活性を出す場合,基質濃度の減少が酵素活性に影響を及ぼすので注意が必要です。酵素量に対する活性のレンジを広げるためには,基質の量を増やす必要があります。ただし,溶解しない場合があるのでできない場合もあります。


Aの場合:
酵素量を変えても観察されるのか?などが不明なのでなんとも言えないですが。反応初期の停滞は,反応開始の温度が低い→プレインキュベーションしている?きちんと混ぜている?。反応後期の停滞は,反応に伴う基質濃度の減少が理由?結論としては,直線で活性値を算出するのが大切かと思います。

(無題) 削除/引用
No.3992-10 - 2015/04/09 (木) 05:44:12 - yyy
酵素反応のグラフで酵素濃度を横軸に片対数でとることの合理性というのはいまいち分かりませんが、その場合にどんなことが起こるかは直感的に理解出来ると思います。
反応産物の生成速度は基本的にEnzyme(E)と基質(S)の複合体ESの濃度に依存し、複合体ESの濃度はEとSの濃度に比例するので、阻害の存在しない単純な反応で基質濃度が十分に高ければ普通はE濃度が上がれば比例して速度も上がる(一定時間後の反応産物濃度)。
だから、低濃度(仮に“1”)のEで始めた場合の産物濃度が1とすればEを10倍にすれば産物濃度は10、Eを100にすれば産物は100、・・・・
もし、ここで酵素濃度が片対数だとすれば、グラフ上での傾きはE=1の時は産物のうども1マス上がるだけなので1、E=10ではEは1から10まで増えますが対数なので1マスだけ、それに対して産物濃度は10倍になるので9マス増えるので傾きが急になります。E=10から100も同様。
酵素濃度が高くなれば、基質濃度が一定だとすれば、多分飽和状態になって酵素濃度上昇に伴う産物濃度の上昇は観察されなくなるのではないでしょうか?

つまり、グラフ上ではシグモイドのようになります。

(無題) 削除/引用
No.3992-9 - 2015/04/08 (水) 23:55:08 - タナ
酵素は精製したものです。実際のグラフを見ながら直接質問できないのが残念です。
勉強してみます。

(無題) 削除/引用
No.3992-8 - 2015/04/08 (水) 21:17:47 - おお
本を読むことをすすめたのは、ここで議論するには生化学の講義からはじめないと理解してもらえないかなと思ったからです。講義するぐらいの内容はここでスペースや費やす時間など考えると無理ですから。

どうやって酵素の活性をはかるのか、シグモイドになる意味はなにか、それを数値化するにはどうしたらいいかなど、全体像をつかんでから質問をされるといいかと思います。

その酵素は精製してからはかってますか?

おおさん 削除/引用
No.3992-7 - 2015/04/08 (水) 19:54:03 - タナ
生化学の本を読んでもなかなか難しく、実際のこの場合にどうなのか分かりやすく教えていただけたらな〜という淡い期待で質問させていただきまぢた。
学生のときにしっかり勉強しておけば良かったです。
学生時代は、わからないことも分かっておらず、今となっては質問しても答えられる人が身近にいなかったり、質問しにくかったりで、先生がいるときに聞いておけば良かったと思っています。
分からないながら、再度生化学の本で勉強してみます。

cDNAさん 削除/引用
No.3992-6 - 2015/04/08 (水) 19:46:10 - タナ
言葉足らずで申し訳ございませんでした。

「濃度依存性」とは酵素の濃度依存性で、「横軸」の単位は酵素濃度になります。
リニアな反応のばあい、その範囲の酵素濃度であれば反応が比例しているように見えますが、シグモイドの場合、酵素濃度の高い所と低いところでそれぞれ差が見えにくいので測定系として良くないのかと思ったのです。
縦軸はリニアです。

> 「反応の立ち上がり」と書かれているので横軸が時間のように思えるのですが、全体を通して、「横軸」と呼んでいる物は同じ話ですか?途中で別の話に変わっていますか?

おっしゃる通り、別の話になっていました。
横軸が酵素の場合に、低濃度のところで直線的でない場合に酵素と基質が反応するまでに量比や結合しやすさなどが影響しているのか?と思っており、
また横軸が時間の場合に、反応の立ち上がりが遅れるとき、これまた基質との結合しやすさや反応の進みやすさが影響しているのか?と思っていました。
これら両方について、直線的でないことの理由が分からずにいました。
先のeeさんのおっしゃるように、見えているかいないかの差なのでしょうか?

eeさん 削除/引用
No.3992-5 - 2015/04/08 (水) 19:26:57 - タナ
ありがとうございます。
横軸を対数でとるのは、キットのメーカーの図でそうなっていたからです。
反応が進むとシグナルが低下する系なので、
元に戻すとミカエリスメンテンの反対のような型の曲線になります。

>理論的には立ち上がりから直線状になる場合でも、実際の実験では検出限界が存在しますので、低濃度領域では検出できずに値が0に近いのだと思います。
> >また、直線に見えても実際は直線ではなく、直線に近似できるだけですよね。

上記、おっしゃるとおりだと思います。
酵素によって立ち上がりが遅いものがあり、それが問題なのかと思っていたのですが、見えていないだけで、どの酵素にも立ち上がりの遅れはあるのですね。

(無題) 削除/引用
No.3992-4 - 2015/04/08 (水) 10:45:41 - おお
生化学の本を一度熟読されることをおすすめします。

(無題) 削除/引用
No.3992-3 - 2015/04/08 (水) 09:29:18 - cDNA
色々勘違いがあるような気がします。
まず、主語を省略しないでください。

「濃度依存性」とは何の濃度ですか?酵素?基質?

「横軸」の単位は何でしょうか?時間?濃度?

横軸を対数にしていて直線性と言っている意味が分かりません。縦軸はリニアですか?縦軸も対数ですか?

「反応の立ち上がり」と書かれているので横軸が時間のように思えるのですが、全体を通して、「横軸」と呼んでいる物は同じ話ですか?途中で別の話に変わっていますか?

(無題) 削除/引用
No.3992-2 - 2015/04/08 (水) 07:56:10 - ee
横軸を対数でとる理由は?
元に戻すとミカエリスメンテン型の曲線になりますか?

理論的には立ち上がりから直線状になる場合でも、実際の実験では検出限界が存在しますので、低濃度領域では検出できずに値が0に近いのだと思います。
また、直線に見えても実際は直線ではなく、直線に近似できるだけですよね。

酵素反応について 削除/引用
No.3992-1 - 2015/04/08 (水) 07:29:17 - タナ
酵素反応で濃度依存性を見る際に、反応が直線的に進んでいくことが一般的かと思うのですが、今回実験した系では反応がシグモイドになります(横軸を対数にして)。

系を比較する場合、直線的に反応するほうが、酵素濃度と活性が比例していてわかりやすいように思うのですが、シグモイドでも問題ないのでしょうか?
シグモイドの直線領域となると、濃度範囲が狭くなるように思います。

同じ酵素、基質を使用した場合、検出系の違いでシグモイドになる系と直線の系、どちらが良いのでしょうか?

また、本来直線的に進むと期待される系で反応の立ち上がりが少し遅く、シグモイドになっている場合、何が起きているのでしょうか?それでも問題はないのでしょうか?そういった反応を示す酵素なのか、酵素に問題があってシグモイドになっているのかの判別がつかず困っています。

いくつも疑問があって分かりにくいかと思いますが、何かアドバイスいただけるとたすかります。よろしくお願いします。

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