大変初歩的な内容なのですが、いくつか試行錯誤しても解決できませんでしたのでトピックをたてました。よろしくお願いします。
今、ヒトの培養細胞からgenomic DNAを回収し、遺伝子変異の有無を調べたいです。
遺伝子変異は特定の変異で、そこを中央に来るようにプライマーを設計、PCRを行い、遺伝子変異をダイレクトシーケンシングで解析する予定です。
培養細胞ですので、細胞をペレットにした後、
100 ulのwaterを加え、95度, 5 min
-> 十分冷ました後、Protease K (10 mg/ml), 15 ulを加え、55度, 2 hrs
-> 95度, 10 minでProK不活化
-> 十分さめた後、上清1 ulを25 ulの反応スケールにてPCRを行いました。
プライマーペアは信頼できるもので、これを利用して共同研究者らは遺伝子変異を解析しています。
PCRの条件は、
95度, 3 min/ - (95度, 30 sec- 58度, 30 sec- 72度, 1 min) -/ 72度, 3 min / 12度
PCRは35サイクルで、アンプリコンサイズは400 bpです。
PCRのかかりが非常に悪く、bandが非常に弱いです。
サイクル数を増やしたりも考えましたが、それよりはgenomic DNAを少しでも精製して、余計なタンパク質のPCR反応への持ち込みを防いだ方が効果的な気がします。
私の研究室にはgenomic DNA精製キットは無く、自作のもので対応できればと思っています。
フェノクロ沈殿は可能でしょうか？エタチンでもOKですか？
当方エタチンの経験があるくらいで、それ以外は経験が無く、調べてもキットが出てきて困っています。
エタチンの場合にはgDNAの溶液に100%EtOH、70% EtOHと順次に加え、それぞれ遠心していけば綺麗な（PCR反応を阻害しない）サンプルが得られますでしょうか？あるいはそれ以外の方法もありましたら教えていただきたいです。
よろしくお願い致します。
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