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脳組織からのタンパク質抽出 トピック削除
No.3987-TOPIC - 2015/04/05 (日) 23:42:50 - 悩脳
マウス脳組織からタンパク質抽出をしてウエスタン、ELISAによる解析を検討しているものです。タンパク質抽出のバッファーは色々な組成のものが各所から売られていますが、down stream でウエスタンやELISA をするときに適した商品をご存知でしたら教えてください。測定対象のタンパク質はサイトカイン類ですが、試しにRIPAw/プロテアーゼ阻害剤で抽出してみたところ、総タンパク質はそれなりにとれていますが、目的タンパク質はいまのところELISAでノーシグナル《mRNAの発現は見えているが本当にたんぱく発現があがっているかは不明》です。RIPAのデタージェントの影響？かわからず、より好適な抽出液があればと思います。よろしくお願いします。
　
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No.3987-11 - 2015/04/22 (水) 11:56:21 - poo
サイトカインだと、放出されてすぐに近くの細胞に取り込まれてしまって、mRNAの発現は確認できるけど、タンパク質レベルだと検出できないこともありそうですね。

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No.3987-10 - 2015/04/21 (火) 23:17:30 - yyy
BCA法だと許容条件が広いからタンパクが取れていると言う情報は間違いなさそうですね。

使用してる抗体はモノクロですか？
リコンビナントと言うのは細菌で発現したものでしょうか？
培養細胞由来のものではエピトープに翻訳後修飾がついてて抗体が結合できない可能性などはあるでしょうか？　
過去に培養細胞由来のタンパクを検出してる実績があれば問題ないと思いますが。

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No.3987-9 - 2015/04/17 (金) 22:29:12 - 悩脳
RIPAをstd希釈液に使ってみましたがEIAバッファと相違ない結果が得られました。
ということでバッファ組成の問題ではなさそうです。

yyyさま
タンパク濃度はBCA法で測っています。

おおさま
バッファのみの系では100 pg/mL くらいです。ELISAポジのサンプルですが、リコンビナントタンパク質は ELISA、WBともポジでした。

いくつかウエスタン/ELISAに使えそうな抽出バッファを入手したので条件検討を続けてみます。役立ちそうな情報が得られたらまた記載いたします。
ありがとうございました。

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No.3987-8 - 2015/04/10 (金) 04:45:02 - おお
ELISA検出感度はどれくらいと思われますか?ELISAで検出できたものにおいて、WBをしたことはありますか?

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No.3987-7 - 2015/04/09 (木) 22:59:25 - yyy
ウェスタンでもダメだったということはELISAのアッセイ系の問題ではなさそうですね。
タンパク定量の方法は何ですか？

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No.3987-6 - 2015/04/09 (木) 22:51:51 - 悩脳
皆様コメントありがとうございます。

yyyさま
ウエスタンもネガでした。リコンビナントは拾えているので抗体は問題なさそうです。

おおさま
確かに、stdの希釈系列を抽出バッファで作製してEIAバッファの値と比較すれば、溶媒の影響がわかりますね。早速試してみます。

monさま
使うELISAはサンドイッチタイプです。上記を見て適切なバッファか判断しようと思います。

mazuさん
ありがとうございます。恥ずかしながらその方法は知りませんでした。ファーストチョイスなんですね。キット付属のEIAバッファでできると系への影響については安心ですね、うちのラボには低温破砕機がないので実施できませんが。。。

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No.3987-5 - 2015/04/07 (火) 22:39:23 - mazu
まずは凍結粉砕して、微粉末にEIAのバッファを入れてよく再懸濁、それを遠心して上澄みを測定するのがファーストチョイス。

(無題) 削除/引用
No.3987-4 - 2015/04/07 (火) 12:36:06 - mon
RIPAは組成によってはSDSが含まれているものがありますので注意。
また、detergentの選択は悩ましいですね。使用量に応じて価格も考慮しないといけないし。サイトカインだと当てはまらないかもしれませんが、例えば注意事項は
http://dominoweb.dojindo.co.jp/goodsr7.nsf/ByChuInfo/03
イオン条件は目的タンパクが存在する状態に近いものを選択するのが普通ですが、細胞内タンパク抽出用に汎用されるKイオンはSDSと沈殿しますので、SDSーPAGEする場合は要注意。Trisイオンやリン酸イオンもある種の酵素（反応）には不向きだったりします。
安価で汎用されるtritonX100やNP-40もELISA plateへの固相化を阻害する可能性大です。サンドイッチELISAなら要考慮（電荷を付加した高結合タイプのプレートならおそらく大丈夫）

(無題) 削除/引用
No.3987-3 - 2015/04/06 (月) 01:40:24 - おお
ウエスタンもそうですがELISAの蛋白抽出用バッファーもELISAで使う抗体などでピンキリだと思います。PBSやTBSでdetergentなしで抽出するものから、マイルドなdetergentを使うもの、またSDSなど強力なdetergentが使えるもの。有機溶媒をつかうもの。

バッファーの影響はスタンダードでそのバッファー有る無しで比較することで確認はできるとおもいます。

(無題) 削除/引用
No.3987-2 - 2015/04/06 (月) 00:59:28 - yyy
ウェスタンの結果はどうだったのでしょうか？

脳組織からのタンパク質抽出 削除/引用
No.3987-1 - 2015/04/05 (日) 23:42:50 - 悩脳
マウス脳組織からタンパク質抽出をしてウエスタン、ELISAによる解析を検討しているものです。タンパク質抽出のバッファーは色々な組成のものが各所から売られていますが、down stream でウエスタンやELISA をするときに適した商品をご存知でしたら教えてください。測定対象のタンパク質はサイトカイン類ですが、試しにRIPAw/プロテアーゼ阻害剤で抽出してみたところ、総タンパク質はそれなりにとれていますが、目的タンパク質はいまのところELISAでノーシグナル《mRNAの発現は見えているが本当にたんぱく発現があがっているかは不明》です。RIPAのデタージェントの影響？かわからず、より好適な抽出液があればと思います。よろしくお願いします。
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