Bio Technical フォーラム

  • バイオ関連の実験をする上での、試薬、機器、プロトコールなどの情報交換の場です。
  • 新しいテーマで話を始める場合、質問をする場合は「新しいトピックを作る」から書き込みをしてください。
  • 質問に対して解答できる方は是非、書き込んで下さい。
  • このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。

新しいトピックを作る　|　トピック一覧　|　研究留学ネットに戻る

ひとつ前のフォーラム（readのみ）

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

大腸菌発現コンストラクト トピック削除
No.3984-TOPIC - 2015/04/04 (土) 12:06:20 - サラリーマン研究員
お世話になります。

大学を出てから数年ぶりに発現コンストラクトを作る運びになって、
だいぶ知識・感覚が薄れていますので、教えて下さい。

大腸菌ホストに1種のプラスミドで異なる2つのタンパク質を作るようなコンストラクトを考えています。システムはpET系です

それぞれのタンパク質の発現を確認する系は構築済み　とお考えください。

pETシステムと和合性のある別種のプラスミドを入れ込んで、2種作ることも選択肢ですが、このトピックでは、とりあえず1種のプラスミドで2つのタンパク質を作ることを考えます。

今回の場合、

T7pro--MCS--(Met-Protein1--ter)--(Met-Protein2-ter)--MCS--T7ter

という感じで作れば、いいような感じがしますが、どうでしょうか。

大腸菌は、ポリシストロニックな転写・翻訳が起きるので、行ける感じもあるのですが…ここらへん、どうだったかな、と

ご意見、ご助言、お願いします。
　
- このトピックにメッセージを投稿する -



全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用
No.3984-6 - 2015/04/05 (日) 08:02:39 - papa
pETマニュアルには気をつけるべきことが詳しく書かれています．
熟読されることをおすすめ致します．

(無題) 削除/引用
No.3984-5 - 2015/04/04 (土) 23:57:55 - サラリーマン研究員
APさま、おおさま
アドバイスありがとうございます。

なるほど、RBSのことには考えが至りませんでした。
2つめのMetの前にも必要と。

pETDuetの情報ありがとうございます。
まぁ、そういう需要はありますでしょうから、プロダクトもありますよね。
当然特許も…。

クリアランスをちゃんと取らないと…。

あと、代謝が苦しくなる気がするので、
リッチな培地とファーメンターでやったほうがよさそうな気がしますね

発現のところで気をつけるべきところなど、
引き続きご意見、ご助言、お待ちしております。
よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用
No.3984-4 - 2015/04/04 (土) 12:49:30 - おお
http://ecoliwiki.net/colipedia/index.php/pETDuet-1
さっきしめしたリンクうまく飛ばないかもしれないので。

(無題) 削除/引用
No.3984-3 - 2015/04/04 (土) 12:46:57 - おお
http://www.emdmillipore.com/US/en/product/pETDuet™-1-DNA---Novagen,EMD_BIO-71146?bd=1#anchor_VMAP

こんなのがありますけどね。
このコンストラクトと同様に、T7pro--lac op--rbs--(Met-Protein1--ter)--T7ter--T7pro--lac op--rbs--(Met-Protein2-ter)--T7terでもいいんじゃないでしょうかね。

ポリシストロニックというのもありうる選択肢ですが、どこにきをつけて、どう言うときに発現がうまくいく、あるいはうまくいかないかなど細かいことにかんして全く感触、知識がありません。

ほかにも、このようなベクターがうってたようなきがします。

(無題) 削除/引用
No.3984-2 - 2015/04/04 (土) 12:41:51 - AP
開始メチオニンだけでは上手くなくて、大腸菌ののribosome binding sequence(
RBS)であるShine-Dalgano sequence（SD sequence）が必要でしょう。発現ベクターにはあらかじめ組み込まれているものがほとんどですが、少なくとも二番目の開始メチオニンの前には入れ込まなければならないでしょう。

大腸菌発現コンストラクト 削除/引用
No.3984-1 - 2015/04/04 (土) 12:06:20 - サラリーマン研究員
お世話になります。

大学を出てから数年ぶりに発現コンストラクトを作る運びになって、
だいぶ知識・感覚が薄れていますので、教えて下さい。

大腸菌ホストに1種のプラスミドで異なる2つのタンパク質を作るようなコンストラクトを考えています。システムはpET系です

それぞれのタンパク質の発現を確認する系は構築済み　とお考えください。

pETシステムと和合性のある別種のプラスミドを入れ込んで、2種作ることも選択肢ですが、このトピックでは、とりあえず1種のプラスミドで2つのタンパク質を作ることを考えます。

今回の場合、

T7pro--MCS--(Met-Protein1--ter)--(Met-Protein2-ter)--MCS--T7ter

という感じで作れば、いいような感じがしますが、どうでしょうか。

大腸菌は、ポリシストロニックな転写・翻訳が起きるので、行ける感じもあるのですが…ここらへん、どうだったかな、と

ご意見、ご助言、お願いします。
全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する
名前 
メール  　アドレス非公開
   タイトル 
本文      
設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます）
上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません）
解決（問題が解決した際にチェックしてください）
暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。
送信 
〔使い方〕
  • 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。
  • 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。
  • 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。