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T7プロモーターを用いたmRNA合成について トピック削除
No.3982-TOPIC - 2015/04/03 (金) 18:25:01 - さっくり
pSP73(Promega)vectorを使って、mRNA合成を行いたいのですが
このベクターはマルチクローニングサイトの後ろから逆向きにT7プロモーターがあります
この場合は、マルチクローニングサイトに逆向きに増やしたいinsertを入れれば良いのでしょうか

また、TaKaRaのInfusion Cloning kitを使ってinsertを入れたいのですが、
primerはinsertの前、後ろのどちらをForwardとすればいいのでしょうか

例えば
あるベクター（配列：gacgttt/aaagtca）の/の位置に、逆向きにinset(配列：atagcggggggg..........ccccccgat)を挿入したい場合は
どのようにprimerを設計すれば良いでようか

どうぞよろしくお願いします。
　
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No.3982-6 - 2015/04/08 (水) 17:14:28 - qw
SP6プロモータからSP6 RNA polymeraseで転写するのではだめなのですか？

(無題) 削除/引用
No.3982-5 - 2015/04/08 (水) 10:42:24 - おお
実験によります。なので一般論としては答えられません。

(無題) 削除/引用
No.3982-4 - 2015/04/08 (水) 10:28:44 - さっくり
おおさん、ありがとうございます

ついでに教えていただきたいのですが、
コザック配列やポリAは入れたほうが良いのでしょうか

よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用
No.3982-3 - 2015/04/03 (金) 21:50:54 - おお
>例えば
>あるベクター（配列：gacgttt/aaagtca）の/の位置に、逆向きにinset(配列：>atagcggggggg..........ccccccgat)を挿入したい場合は
>どのようにprimerを設計すれば良いでようか

mRNAの配列が例えば
5' atagcggggggg..........ccccccgat 3' であれば

プライまーは 5' atagcggggggg...3'と
5' atcgggggg... 3'でどんな場合でも対応できます。もし制限酵素認識部位を追加したければ各プライまーの5'側に追加してください。

(無題) 削除/引用
No.3982-2 - 2015/04/03 (金) 21:21:21 - おお
T7 promoterの配列5'-TAATACGACTCACTATA-3'(ベクターによりバリエーションがある可能性はある) の3'側からtranscriptionが始まります。

すなわち、上記配列の下流3'側に発現したいRNAの5'側がくるようにconstructを組めばいいです。

ベクターのマップの作り方からみれば、逆向に見えるでしょうけど、マップの作り方をかえれば正方向にも見えるので、逆とか感じるということに惑わされているだけかと思います。

単純にするには上記の配列が+の鎖になるようにして、+の鎖が5' -> 3'のむきになるようにT7 promoterとマルチクローにんぐサイトの部分だけ書き出したらいいです。

Forwardとか見たい配列とか、参照した配列からかってに人がつけるわけで、それはどう名付けても配列を把握していれば間違えるわけはないと思いますが、たいていはmRNAであればその配列の5'側に設定するプライまーがForwardです。

もしそのcDNAなどのantiーsenseの配列に興味があるなら、センス鎖からみてリバースの位置にあるものが5'にくるわけで、センス鎖を基準にリバースといってもいいしアンチセンス鎖を基準にフォワードといってもかまいません。

T7プロモーターを用いたmRNA合成について 削除/引用
No.3982-1 - 2015/04/03 (金) 18:25:01 - さっくり
pSP73(Promega)vectorを使って、mRNA合成を行いたいのですが
このベクターはマルチクローニングサイトの後ろから逆向きにT7プロモーターがあります
この場合は、マルチクローニングサイトに逆向きに増やしたいinsertを入れれば良いのでしょうか

また、TaKaRaのInfusion Cloning kitを使ってinsertを入れたいのですが、
primerはinsertの前、後ろのどちらをForwardとすればいいのでしょうか

例えば
あるベクター（配列：gacgttt/aaagtca）の/の位置に、逆向きにinset(配列：atagcggggggg..........ccccccgat)を挿入したい場合は
どのようにprimerを設計すれば良いでようか

どうぞよろしくお願いします。
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