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(無題) 削除/引用 No.398-21 - 2012/04/18 (水) 21:12:36 - モモ 何ｍMの塩で結合させ、何ｍMの塩で洗浄し、何ｍMの塩で溶出するかという、基本的な条件の検討ができてないのですね。それならまともに精製できるわけないのでは・・・

(無題) 削除/引用 No.398-20 - 2012/04/17 (火) 23:20:08 - たま qqさま いえいえ全然失礼な事だとは思ってはおりません。 というより、私自身がこの精製法は初めてですので知識が乏しいですので、そういう印象を持たれたのは非常に参考になります。 ただ、参考にしている論文はカラムと反応させる前のクルードなサンプルには多くのバンドがあるのに対し、溶出は非常に綺麗な一本のバンドです。一度詳しく聞いてみた方が良さそうですね。ありがとうございます。 gqさま そうなんです。全く同じ条件を整えて実績のあるタンパク質の精製ですので苦しいです。 オリジナルの方法ではゲルろ過は挟んでいないようです。クルードなサンプルをそのまま脂質を結合させたoctyl-sepharoseに投入しています。一度、先方に詳しく聞いてみます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.398-19 - 2012/04/17 (火) 23:09:29 - たま qqさま いつも的を得たご指摘ありがとうございます。 はい、HICです。サンプルは菌体を含まない培地上清になります。 その大腸菌が出すendogenousな物を精製する予定です。そのため全体のタンパク質の5%程度が欲しいものになります。 >硫安沈殿を一発で沈殿させるのではなく、いくつかの硫安濃度で分画するべきです。 >その硫安濃度で平衡化したオクチルにロードするほうが、吸着が望めます。 非常に心強いです。本当にありがとうございます。 ただ生理活性を維持した状態で精製に持って行きたいため、上司は硫安サンプルは即座にPBS透析するべきだと以前言われました。ただ、qqさまの仰るように硫安で溶解したサンプルでも吸着しますよね。ちょっとこの辺私もそれほど詳しくありませんので、まずきちっと勉強してみます。 また、質問してしまうかもしれませんが、その際は恐縮ですがどうぞよろしくお願い致します。 ajiさま >脂質を結合していなければ普通の疎水カラムです。ある程度の種類のタンパク質が結合する方が自然です。 誠に仰る通りです。ただ、私が参考にさせていただいている論文と全く同じ物を使用して、同じ物を精製する予定ですが、その論文では溶出後のサンプルのCBBでは欲しいbandただ一つの非常に綺麗なデータでした。なぜ望まないものが取れてこないのかは疑問です。一度その方に聞いてみます。 また、その大腸菌培養上清中の欲しいタンパク質は生理活性は（全体の100 %かどうかはわかりませんが）維持しているので、sepharoseに結合した脂質にも結合できるだろうと思っています。ちなみに有機溶媒で脂質がカラムから溶出されましたので脂質はカラムに結合していることは確認しています。 SPRで思いつきましたが、もしかしたらsepharoseに結合させる脂質が不十分で、そのため疎水性クロマトが十分に発揮され望まないタンパク質が疎水性相互作用により多く取れてきてしまったのかもしれませんね。私が精製したい培養上清のタンパク質と脂質は疎水性相互作用で結合するわけではないので、もしかしたら脂質のconjugationの過程を工夫すれば望まない物が減るかもしれません。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.398-18 - 2012/04/17 (火) 22:55:07 - たま taroさん なるほど完全合成培地というものがあるのですね。 1st choiceとして一般的にやられるものなのでしょうか？一度調べてみます。 ありがとうございます。 モモさん 私が参考にしている論文では、溶菌したサンプルを直接疎水クロマトに持ち込んでいます。 他の方がかかれているように疎水クロマトであれば結構色んな物がベタベタと結合してもおかしくはないのですが、その論文では目的の物だけが綺麗に精製できています。 ただ、その先生のsepharoseからの溶出方法は高濃度の塩を利用していますが、私の場合、溶出はSDS-sample bufferで行っています。もしかしたら高濃度の塩では望まない物は溶出されてこず、欲しい物だけが溶出されるような仕組みがあるのではと思いました。しかし、私の行った実験では欲しい物はsepharose自体にも結合しないようでしたので、kick outされているのかもしれません。 イオン交換を挟むのは良い手ですね。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.398-17 - 2012/04/16 (月) 05:14:40 - gq たぶん、octyl-sepharoseを用いての精製実績がある蛋白なんですよね。オリジナルの方法では長さ1 mくらいのカラムを使ってのゲル濾過を挟んであるんでしょうか？少し費用がかかるかもしれませんが、なるべく同じ方法でやるのがいい気がします。うまくいくと良いですね。

(無題) 削除/引用 No.398-16 - 2012/04/15 (日) 15:56:00 - qq octyl-sepharoseにリポソームを結合させて、そこに結合する分子を探したいのですね。 失礼ではありますが、「ちょっと、無理じゃん？」というのが感想です。 リン脂質のミセルにして、ショ糖勾配で遠心分離のほうがまだ現実味があるかもと思います。 世の中には、磁性ナノ粒子を封入したリポソームもあるようなので、その辺の磁気分離を使うのもチャレンジングではあります。

(無題) 削除/引用 No.398-15 - 2012/04/15 (日) 15:27:36 - aji >脂質をoctyl-sepharoseに結合させる とのことですが、これがアフィニティーカラムとして機能するなら、確かにその脂質へのアフィニティーで結合しているのでしょうが、必ずしもそうなるとは限らないのではないでしょうか。 >「脂質を結合させていない」octyl-sepharoseにも上清中の多くのタンパク質が結合してきてしまいました。 これはアフィニティーカラムだとの思い込みからこの様な表現になっているのだと思います。脂質を結合していなければ普通の疎水カラムです。ある程度の種類のタンパク質が結合する方が自然です。 このフロースルーを脂質を結合させたカラムに通せば選択的に結合するかもしれませんね。しかし、特定の脂質に結合することを期待しているのであれば、発現タンパク質が本来の立体を保っていることが必要なので、そこが期待通りでないかもしれません。 他の可能性として、発現タンパク質と目的の脂質と結合する部分が既に何かで占有されていてカラムに保持した脂質と相互作用できないのかもしれませんね。 脂質がカラムに結合していることは確認出来ているのでしょうか。脂質と担体の比率も結果に影響します。アフィニティーカラムの作成法としてはSPRの疎水面にリガンドを結合した脂質を結合させる操作が似ていると思うので、そのような実施例が参考になりそうです。

(無題) 削除/引用 No.398-14 - 2012/04/14 (土) 10:14:06 - qq hydrophobicですね。 疎水クロマトの原理や使用例をたくさん調べてみるべきですね。GEのHPにあるかもしれません。 硫安沈殿させて、PBS透析してオクチルにのせたようですが、改善の余地がありそうです。 硫安沈殿を一発で沈殿させるのではなく、いくつかの硫安濃度で分画するべきです。 得られた沈殿を溶ける程度の硫安濃度で溶解して、その硫安濃度で平衡化したオクチルにロードするほうが、吸着が望めます。 硫安の濃度を低下させることで、溶出可能かもしれません。 場合によっては、界面活性剤を使わないと溶出できないかもしれません。 ところで、大腸菌培養上清とは、菌体を含まない培地上清のことですか？それとも大腸菌を破砕した遠心上清のことですか？

(無題) 削除/引用 No.398-12 - 2012/04/14 (土) 08:46:41 - モモ まずはアフィニティー精製の条件を検討するのが先ではないですか？ 硫安沈殿後のバッファー条件やビーズの量、洗浄と溶出の条件など、どこまでやりましたか？

(無題) 削除/引用 No.398-11 - 2012/04/14 (土) 01:15:10 - taro 全く詳しくないので、思いついた事だけ。 大腸菌を培養する培地をLBとかじゃなく完全合成培地にしたら硫安沈殿が少しきれいになったりしないのでしょうか（特にサイズの小さい部分）？ mon様の提案にあるようにDEAEなどのイオン交換（で安そうなもの）を挟むのも良さそうですね。

(無題) 削除/引用 No.398-10 - 2012/04/13 (金) 22:09:21 - たま ~さま ありがとうございます。 確かに、その硫安のプレパレーションである程度条件を振れば粗精製できそうですね。 ただ、このサンプルは共同研究先からいただいたもので今すぐにそれを試すことは出来そうにもありません。が、ぜひ検討してみます。ありがとうございます。 うさま >私は、それは無いのではないか？とちょっと思います。 豊富な経験から基づいた感覚をお示しくださり大変感謝しています。 スタートの硫安後の透析サンプルの総タンパク質量としてはおおよそ1 mg/ml程度です。 biotechnical forumを遡って拝見すると、sepharose担体はもともと非特異的吸着が少ないものとして利用されているとのこと。私の手技の問題かもしれませんが、どう改善すればよいか皆目検討も付きません。 まず、その脂質をoctyl-sepharoseに結合させるまでを書かせてください。 1. octyl-sepharose in 20 % EtOH/H2OをミリQ水で３回洗浄 2. 0.2 M KCl/H2Oにてsepharoseの平衡化（１時間、室温） 　＊KClを入れることで疎水性相互作用を高めています。 3. 脂質をsepharoseに結合させるため、乾燥した脂質に熱した0.2 M KCl/H2Oを入れ超音波処理後、同bufferで平衡化したsepharoseと混和、2時間、室温 4. sepharoseをPBSで３回ほど洗浄、続けてPBSで平衡化、1時間、室温 5. 大腸菌培養上清（硫安後PBS透析サンプル;総タンパク質濃度1 mg/ml）を加え、室温、2hrs-O/N 6. sepharoseをPBSで３回ほどよく洗浄。 7. 2x SDS sample bufferを加え入れ、sepharoseと結合したタンパク質の溶出 8. CBB染色、or western blottingです。 脂質を結合させていないintactなoctyl-sepharoseにも様々な大量のタンパク質が結合してしまいます。平衡化が足りないのでしょうか？preclearや塩強度を上げたりすることで解決できるのでしょうか。 長文大変恐縮ですが、みなさまの貴重な経験談をお聞かせ願えますと幸いです。

(無題) 削除/引用 No.398-9 - 2012/04/13 (金) 21:53:22 - たま monさま ありがとうございます。 当方、イオン交換クロマトは行ったことがありません。 これに関してはまずよく調べ検討してみます。ありがとうございます。 abさま ありがとうございます。 仰る通り、限外ろ過の分子量は思ったほど厳密でないことを目の当たりにしました。 >目的タンパク質が全くカラムにつかないのか、ほぼ全て回収できているけど純度が低いのか？ はい、目的のタンパク質が全くカラムにつきません。 qqさま 情報が不足しており、申し訳ありません。 私はOctyl-sepharoseを利用して疎水性相互作用クロマトを行っています。 このsepharoseにはoctyl基という疎水性のアルキル基が付いています。私はこのsepharoseにまず、同様にアルキル基を持つ脂質を結合させたものをaffinityクロマトとして使用しています。 つまり、この脂質と相互作用するタンパク質を釣り上げるためのaffinityクロマトです。 大腸菌培養上清の硫安後透析サンプルをこのカラムに通すと、その脂質と結合するとすでに報告されているものであっても、結合がみられませんでした。 というより、「脂質を結合させていない」octyl-sepharoseにも上清中の多くのタンパク質が結合してきてしまいました。ノンスペを減らす方法があればぜひ試してみたいのですが。。

(無題) 削除/引用 No.398-8 - 2012/04/13 (金) 21:44:03 - たま マルチさま ありがとうございます。 早速目的の70kの蛋白がアミコンによって、100k cut offでスルーしたものを30k cut offで濃縮されるかを確認しました。 結果は、100kのアミコンではスルー画分に回収されませんでした。。 それ以外の多くの蛋白も100kのスルー画分には来ず、でした。 出発材料は比較的豊富にあります。硫安後にPBS透析したものが50 ml程度あり、70kの目的の物の濃度はおおよそ100 micro gram / ml程度です。

(無題) 削除/引用 No.398-7 - 2012/04/13 (金) 07:54:33 - う 素朴な疑問・・・ ＞これらを目的のaffinityカラム（sepharose）に流すと非特異的なものが多く取れてきてしまい、欲しいサイズの物が特異的に取れてきません。おそらくよりaffinityが高い何かがより早くsepharoseに結合してしまい、目的のものをkick outしているのだろうと考えています。 言いたいことはわかるのですが、affinityカラムに、 目的タンパク質が発現していない大腸菌の培養上清から 同じような作業をした場合も何かタンパク質が結合するのでしょうか？ 私は、それは無いのではないか？とちょっと思います。 もし、あるとしたら、スタートのタンパク量が多すぎなのでは？ もしくは、目的タンパク質がaggregationしやすかったりすると、 最初は可溶性であっても、周りのいろんなタンパク質を巻き込んで 小さな粒子を作って、いくら精製してもいろんなタンパク質が検出される とか。

(無題) 削除/引用 No.398-6 - 2012/04/12 (木) 14:49:53 - ~ ぴったり当てはまるものがあれば使い物になるのでしょうけれども、限外ろ過フィルターユニットの種類は少ないですよね… >1 mほどのカラムもない スピンカラムのことをさしているのでしょうか。 注射器を使って自作すると安上がりですよ。 限外ろ過フィルターユニットを新たに購入する予定であれば、こちらも検討に値するでしょう。 >硫安沈殿後 書かれている感じだと、1stepで沈殿させているのでしょうか。 精製とまでいかなくても、分画できるステップです。 古典的ですが、低めの硫安濃度+遠心分離で不要タンパク質を落とした後で、 目的タンパク質が沈殿する濃度に上げてはいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.398-5 - 2012/04/12 (木) 11:24:57 - qq ＞ゲルろ過に用いる1 mほどのカラムもないため、 ここの意味が判りません。何か誤解の匂いがします。 アミコンでモルカットは、まあやっってもいいけど、、、、です。 基本的にSDS-PAGEで70kDaだったタンパクがナマの溶液で70kDaである保証はありません。70kDa同士がオリゴマーを形成していると、100kDaでカットされてしまいますよ。 アフィニティーカラムがうまく行っていないようなので、使っているアフィニティーカラムの正体を明かす方がよい収穫があるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.398-4 - 2012/04/12 (木) 07:48:23 - ab 煩雑なタンパク質を除くために、アフィニティーリガンドがついてない担体で前処理するときれいになることもあります。 目的タンパク質が全くカラムにつかないのか、ほぼ全て回収できているけど純度が低いのかで対応も変わってくると思いますが、いかがでしょうか？ 限外濾過の分子量はそんなに厳密ではないです。 70 kDaの目的タンパク質を30 kDaと100 kDaの限外濾過膜で上手く濃縮できるかどうかは、タンパク質の構造にもよるのでなんともいえませんが、ロスなどを考えるとあまりおすすめできないです。

(無題) 削除/引用 No.398-3 - 2012/04/12 (木) 06:14:36 - mon イオン交換は？ロスもほとんどないし、バッチ処理で行えば特別な機器も不要です。

(無題) 削除/引用 No.398-2 - 2012/04/12 (木) 00:40:02 - マルチ 仮説が正しいのなら、一回目のスルー液を新品のアフィニティカラムに通せばOK。 サイズフラクションにアミコン使うのもアリだと思うけど、アミコンはロスが多いし、濃縮中に凝縮したりするから使いどころが難しい。 出発材料が豊富なら問題無いけど。

大腸菌培養上清からのタンパク質精製 削除/引用 No.398-1 - 2012/04/11 (水) 23:23:21 - たま いつもお世話になっております。 これから大腸菌培養上清からタンパク質を精製したいと考えております。 目的のサイズは70kDaで、その培養上清は硫安沈殿後、PBSに対して透析を行っています。 これらのサンプルをCBB染色すると、全体の5%程度が目的のタンパク質のようです。 この溶液はほんの少し粘性があり、培地の色も少し残っています。 これらを目的のaffinityカラム（sepharose）に流すと非特異的なものが多く取れてきてしまい、欲しいサイズの物が特異的に取れてきません。おそらくよりaffinityが高い何かがより早くsepharoseに結合してしまい、目的のものをkick outしているのだろうと考えています。 この場合の対処方法と致しまして、 1. ゲルろ過をはさむ 2. 限外ろ過により目的の分子量を持つものを濃縮する です。しかし、硫安サンプルは粘性もある程度あり、ゲルろ過に用いる1 mほどのカラムもないため、2の方法で絞り込むことを考えています。その後、sepharoseのaffinity クロマトを行う予定です。 私はタンパク質精製が初めてなものですので、お聞きしたいのは例えば100 kのcut offのアミコンでpass throughされてきたサンプルを、30 kのcut offのアミコンを使って濃縮されるものを次のaffinity クロマトに持ち込むというのは常法なのでしょうか？目的の欲しいサイズは70 kです。 どうかタンパク質精製のそこら辺りのコンセンサスを教えていただけますと幸甚です。 拙い文章で申し訳ありませんが、みなさまのご意見伺えますと幸いです。

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