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短いペプチドを用いたdot blot トピック削除
No.3978-TOPIC - 2015/04/02 (木) 03:50:04 - okam
お世話になっております。

現在抗体を作製中で、抗血清の抗原ペプチドに対する反応性の検証のため、その抗原ペプチドを用いてdot blotを試みております。抗原ペプチドの大きさは15aa程度です。
Dot blot用デバイスを用いてペプチドを何点かブロット(最高100ug)した後、通常のWBのトランスファー後の過程（ブロッキング、一次抗体、洗浄、二次抗体、洗浄）を行い、ECLにて検出を行っております。
ニトロセルロース膜、Immobilon-P(sq)膜（共にポアサイズ0.2um）を試しましたが、目的のシグナルが全く得られません。二次抗体の非特異的膜吸着に由来するものであろうシグナルが膜全体から得られるだけです。
ポジコンとして行っている3XFLAGペプチドとFLAG(M2)抗体を用いた並行実験でも何もシグナルが得られないため、悩んでおります。

やはり短いペプチドの膜吸着性は低く、WBの作業中に膜からはがれてしまうのでしょうか？経験のある方がいらっしゃいましたら、ご教授いただけると幸いです。よろしくお願いいたします。
　
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(無題) 削除/引用
No.3978-13 - 2015/04/05 (日) 00:01:06 - おお
ちなみに低分子吸着用に0.1ミクロンのメンブレンもうっているよ。

(無題) 削除/引用
No.3978-12 - 2015/04/04 (土) 23:57:45 - okam
皆様多くの情報ありがとうございます。頂いた情報にもとづき、

1. ペプチドが結合できるように表面修飾されたプレートを用いてのELISA
2. キャリアーにペプチドを結合させてのdot blot

の方向性で再度取り組んでみたいと思います。

(無題) 削除/引用
No.3978-11 - 2015/04/03 (金) 09:57:38 - AP
>やはり短いペプチドの膜吸着性は低く

短いペプチドは支持体に結合しないのは普通で、能書きによると20 kDa以下の低分子量のタンパク質もいけますというImmobilon-Psqでさえ一応10 kDaが限度とされているようです。いまはあまり見かけませんが、特別にペプチドが結合できるように表面修飾したメンブレンやELISAプレート製品があるくらいです。


ペプチドを重合させるとかキャリアーにconjugateするとかしたら容易に結合するでしょう。ただし、免疫の時に使ったキャリアを使うとそれに対する抗体が反応してしまう可能性があるので注意です。
>BSAなどと混ぜてみたことはなかったので
BSAにconjugateして免疫するのもよくあるので確認して下さい。

あえてペプチドのままブロットするなら、やはり液流があると素通りしてしまうので、滴下して吸い込ませ、外れにくくするために一旦乾燥させるのがいいと思います。ミリポアが乾燥させたPVDF膜ブロットを再親水化せずに抗体検出する方法を紹介していたと思います。

(無題) 削除/引用
No.3978-10 - 2015/04/03 (金) 07:06:38 - おお
>私も実績があり一般的なELISAプレートの方が良いと思いますが、plate readerが無いため（？）発光での検出

数が多くないんだったら分光吸光度計でもいいよ。
スタンダードを3倍希釈ぐらいでとって、目でスタンダードのどことどこの間というラフな数字もだせますし。

>Westernblotの撮像装置で発光測定が可能

ライトボックスの上に透明なプレートをおいて、デジタルカメラでとると、発色が強いところは暗くなるので、数値化できます。フィルターがあればベターだけどなくてもできると思います。

(無題) 削除/引用
No.3978-9 - 2015/04/03 (金) 06:35:50 - mon
私も実績があり一般的なELISAプレートの方が良いと思いますが、plate readerが無いため（？）発光での検出に拘っているのかと。
黒色（白色）のELISA palteならWesternblotの撮像装置で発光測定が可能だと思います。
サンプルでもらって試してみれば。

(無題) 削除/引用
No.3978-8 - 2015/04/02 (木) 21:47:20 - qw
ノーシグナルなのか、バックグラウンドだらけなのか？
ImmoPsqよりも、ImmoP（0.45um）の方が良いかもしれません。
抗原を何に溶解してるのかは重要なところでしょう。
可能であればPBSに溶かすのが良いと思います。NC膜であれば、0.5M NaClや10mM MgCl2が有効な場合があります。
おおさんの指摘のように、ELISAプレートの方が良いだろうと思います。1-10ug/mlのペプチドで普通のELISA-plateに固定化できます。スキムミルクかBSA（抗原にBSAを使っていなければ）でブロッキングすれば良いです。詳細は、自分で調べることが可能です。

(無題) 削除/引用
No.3978-7 - 2015/04/02 (木) 21:03:38 - okam
皆様、多くの情報ありがとうございます。
早速試してみたいと思います。

>[Re:6] monさんは書きました :
> Dot blot用デバイスは、吸引するタイプですよね？
> (1)peptideを吸着させるときには、吸引しないで1時間ほど放置し、その後吸引。
> (2)ブロッキング剤を変える
> (3)界面活性剤(tween,triton等）を含まない洗浄液を用いる
> くらいかな？

洗浄バッファーにtweenが含まれているので、含まないものを用いてみます。

>[Re:5] APさんは書きました :
> >ニトロセルロース膜、Immobilon-P(sq)膜
> て、ニトロセルロース膜じゃないじゃ。-PはPVDFのことじゃなかった？
> 血清の力価を調べるアッセイでは、普通、一定量の抗原を固相化して血清の希釈列を反応せせるもんだと思いますが。

ニトロセルロース膜とImmobilon-P(sq)膜の両方を試しました。血清の希釈については、十分量の抗原と血清原液で実験系がはたらいた後に行おうと考えております。

>[Re:4] mbbさんは書きました :
> ペプチドシークエンスなどで用いる
> ポリブレン処理したグラスフィルタが
> 有効かもしれません。

グラスフィルタというものを扱った経験がないのですが、簡単に手に入るものなのでしょうか？

>[Re:3] APさんは書きました :
> おそらくNC膜ではブロット（吸引式ですよね）の段階で素通りしています。
> やるならピペットで滴下して乾燥させるとまだマシだと思います。

おっしゃるとおり吸引式のものです。自然乾燥の方がやはりいいんでしょうかね？


>[Re:2] おおさんは書きました :
> ELISA ではだめなのですか?
> BSAなどにくっつけてtransferするとか、グルタルアルデヒドなどで固定するとか。

ELISAは考えていなかったです。固定は、酢酸＋イソプロパノールとKOHを試してみたのですが、BSAなどと混ぜてみたことはなかったので、やってみたいと思います。

(無題) 削除/引用
No.3978-6 - 2015/04/02 (木) 12:23:15 - mon
Dot blot用デバイスは、吸引するタイプですよね？
(1)peptideを吸着させるときには、吸引しないで1時間ほど放置し、その後吸引。
(2)ブロッキング剤を変える
(3)界面活性剤(tween,triton等）を含まない洗浄液を用いる
くらいかな？

(無題) 削除/引用
No.3978-5 - 2015/04/02 (木) 12:10:59 - AP
>ニトロセルロース膜、Immobilon-P(sq)膜
て、ニトロセルロース膜じゃないじゃ。-PはPVDFのことじゃなかった？

>Dot blot用デバイスを用いてペプチドを何点かブロット(最高100ug)した後、
血清の力価を調べるアッセイでは、普通、一定量の抗原を固相化して血清の希釈列を反応せせるもんだと思いますが。

(無題) 削除/引用
No.3978-4 - 2015/04/02 (木) 09:23:27 - mbb
ペプチドシークエンスなどで用いる
ポリブレン処理したグラスフィルタが
有効かもしれません。

(無題) 削除/引用
No.3978-3 - 2015/04/02 (木) 09:22:32 - AP
おそらくNC膜ではブロット（吸引式ですよね）の段階で素通りしています。
やるならピペットで滴下して乾燥させるとまだマシだと思います。
できればPVDF膜のほうがいいかもしれません。１スポット100 ugはめちゃくちゃ多すぎじゃないですか。抗体ができていればng, pgオーダーで検出できるでしょう。定量的に膜に吸着できるレンジはそんなに広くないはずです。

(無題) 削除/引用
No.3978-2 - 2015/04/02 (木) 05:42:50 - おお
ELISA ではだめなのですか?
BSAなどにくっつけてtransferするとか、グルタルアルデヒドなどで固定するとか。

膜のキャパの範囲内でBSAを混合して、吸着後グルタルアルデヒドなどで固定したりするとはがれないで残るものがおおくなるかとおもいます。

吸着するときにメタノールなどを溶液に入れることができればよりいいかもしれません。

短いペプチドを用いたdot blot 削除/引用
No.3978-1 - 2015/04/02 (木) 03:50:04 - okam
お世話になっております。

現在抗体を作製中で、抗血清の抗原ペプチドに対する反応性の検証のため、その抗原ペプチドを用いてdot blotを試みております。抗原ペプチドの大きさは15aa程度です。
Dot blot用デバイスを用いてペプチドを何点かブロット(最高100ug)した後、通常のWBのトランスファー後の過程（ブロッキング、一次抗体、洗浄、二次抗体、洗浄）を行い、ECLにて検出を行っております。
ニトロセルロース膜、Immobilon-P(sq)膜（共にポアサイズ0.2um）を試しましたが、目的のシグナルが全く得られません。二次抗体の非特異的膜吸着に由来するものであろうシグナルが膜全体から得られるだけです。
ポジコンとして行っている3XFLAGペプチドとFLAG(M2)抗体を用いた並行実験でも何もシグナルが得られないため、悩んでおります。

やはり短いペプチドの膜吸着性は低く、WBの作業中に膜からはがれてしまうのでしょうか？経験のある方がいらっしゃいましたら、ご教授いただけると幸いです。よろしくお願いいたします。
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