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アガロースゲル電気泳動のウェルの漏れ トピック削除
No.3968-TOPIC - 2015/03/27 (金) 16:17:29 - TS
いつも勉強させてもらっています。

DNAのアガロースゲル電気泳動ですが、
時々、ロードしたサンプルがウェルの底から漏れてしまう現象に会います。

この現象は、みなさまには起きませんでしょうか。

サンプルをローディングする時に穴を作ってしまっていることはなく、
おそらくコームを抜くときに亀裂?が入っていると思います。
そうっとコームを抜いているつもりですが、それでもたまに起きてしまいます。

0.5%程度のゲルを作ることが多いです。
アガロースはニッポンジーンのagaroseSを使っています。

もし同様の現象になったことがある人がいて、対策として
気を付けていることなどありましたら教えていただけると助かります。

よろしくお願いします。
 
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(無題) 削除/引用
No.3968-11 - 2015/03/28 (土) 08:29:21 - あるえないぞ
余談ですが、

=たのむからアガロースの温度がある程度低下してから注ぐようにして下さい

20年以上注意しながら使ってきた、ミュ??ッドのトレイと、最近買った、新品のトレイを比較したら、新品のトレイの方がそっていました。

メーカーにクレイムをつけたら、営業の方が見に来て、感動して帰った後に、できるだけそりの少ないトレイを代わりに送ってきました。

たぶん、トレイ等の生産体制がかわって、当たり外れがありえますので、新品でも注意をした方がよいです。

(無題) 削除/引用
No.3968-10 - 2015/03/27 (金) 20:50:23 - おお
>コームを抜くときに泳動バッファーで水浸しにする
これは私もやってます。改善されると思っています。

(無題) 削除/引用
No.3968-9 - 2015/03/27 (金) 18:44:17 - TS
みなさま:

迅速なご助言ありがとうございます。

トレイとコームの歪みを確認しましたが、それらは大丈夫なようでした。
アガロース溶液の温度については、日頃から気を付けているつもりです。

一方で、確かにトレイの下に少し気泡が入っているときがあることは記憶しています。

次からは、ゲルを少し注いでから、トレイを押し付けて気泡を抜いてから残りを注ぎ、再度トレイが密着しているか確認するようにします。

また、APさんが行っている、コームを抜くときに泳動バッファーで水浸しにする、も組み合わせてみようかと思います。コームを引き抜くときにかなり抵抗を感じており、その時にウェル付近のゲルがゆがむことがあるので、以前から気になっておりました。

ビニルテープで下駄を履かせるのも、確実に底を作るためには良い方法ですね。
ただ現状では、トレイも歪んでおりませんし、下駄を履かせるとローディング可能容量が減ってしまうので、他の方法で対応してみて、どうしても駄目だった場合に、試してみたいと思います。

いろいろとありがとうございました。
漏れの確率をぐっと低くできるような気がします。

(無題) 削除/引用
No.3968-8 - 2015/03/27 (金) 18:01:21 - AP
>このような場合はゲルを注いだ後にトレイをチップなどで台に押し付けて、全面を密着させる方法があります。

これは、歪みとか反りとか関係なく、Mupidの使用説明書に書いてある手順なのです。

まあ、Mupidの使用説明書をちゃんと読みで使っている人は、あまりいないかもしれないし、現物はあってもの添付説明書はどこにもないというラボも多いだろうが。

(無題) 削除/引用
No.3968-7 - 2015/03/27 (金) 17:57:48 - AP
>あと、世界中の研究者の皆様にお願いなのですが、ゲルメーカースタンドをゆがませないためにたのむからアガロースの温度がある程度低下してから注ぐようにして下さい・・・どこに行ってもゆがんだスタンドばかりでほんと困ってます。

耐熱性もあるでよ。
http://www.mupid.com/gms_hr/

>ミューピッドだと思いますが、コームとトレイの間のスペースがもともとすごく狭いのでちょっとでもゲルメーカースタンドがゆがんだりするとコームの先とトレイがくっついてしまい穴あきにつながります。
>コームの足の部分(コームとゲルメーカースタンドを組み合わせる部分)にビニールテープを2~3枚貼り付けて持ち上げることにより、コームとトレイの間のスペースが広くなるように工夫しています。

歪みのせいばかりでないかもしれません。
うちも、ビニテで下駄を履かせてたことあるんですが、結局、先に書き込んだような方法で作り方を徹底したら、ちゃんした底ができることがわかってやめました。
下駄を履かせるとウェルが浅くなるので、ロード量が少なくなってしまいますし。。ちゃんとつくれば、大ゲル25ウェルで、1ウエルに10uL強、13ウェルで15 uLくらい入ります。

(無題) 削除/引用
No.3968-5 - 2015/03/27 (金) 17:37:14 - AP
コームを抜くときに、ウェル付近を純水か泳動バッファーで水浸しにします。ウェルが陰圧にならないようにコーム抜いた分だけ、水・バッファーが入っていくように注意しながら抜きます。コームを水平に引き抜くと圧の逃げ道がないので、やや斜めに抜くとか、若干、前後に傾けながら抜くとかして工夫します。要は、プリンを型から抜くのと同じ。

市販のゲルメーカー板は、正しく使えば十分に厚みのあるウェルの底ができます。いい加減な使い方をすると、ウェルの底が薄くなったりコームがが突き抜けてしまうために底漏れを起こします。

ゲルメーカー板をプレートにセットした状態でアガロース液を注ぐと、浮力で浮き上がってコームの先端と底面が近接して、ウェルが浅くなり底が薄くなります。

プレートに少量のアガロース液を注いでからゲルメーカー板をセットし、その上から適量のアガロース液を注げば、ゲルメーカー板の裏の空気が追い出されて、浮き上がることなく密着します。注ぎ終わったら、さらにピペットなどでメーカー板を押し付けておけば安心です。

熱々を注がないために 削除/引用
No.3968-4 - 2015/03/27 (金) 17:23:40 - 774R
>アガロースの温度がある程度低下してから注ぐようにして下さい

以前いたラボでは、半分の量のバッファーでアガロースを溶かして、後から規定量になるように室温のバッファーを加えて適温にしてから注いでました。

今いるラボでは溶かした後、60-65℃のインキュベーターに入れて溶けた状態で保存しています。その都度溶かさずに済むので大変便利です。但し回転が悪いと劣化するので、使用頻度が低いラボではオススメできません。あと、アガロースの精製度の問題だと思いますが、中には茶褐色に変色するアガロースもありますので注意が必要です。

(無題) 削除/引用
No.3968-3 - 2015/03/27 (金) 17:07:38 - アンジョリーナ・ジェリー
http://www.mupid.com/gms/

ミューピッドだと思いますが、コームとトレイの間のスペースがもともとすごく狭いのでちょっとでもゲルメーカースタンドがゆがんだりするとコームの先とトレイがくっついてしまい穴あきにつながります。

コームの足の部分(コームとゲルメーカースタンドを組み合わせる部分)にビニールテープを2~3枚貼り付けて持ち上げることにより、コームとトレイの間のスペースが広くなるように工夫しています。

あと、世界中の研究者の皆様にお願いなのですが、ゲルメーカースタンドをゆがませないためにたのむからアガロースの温度がある程度低下してから注ぐようにして下さい・・・どこに行ってもゆがんだスタンドばかりでほんと困ってます。

(無題) 削除/引用
No.3968-2 - 2015/03/27 (金) 16:25:06 - cDNA
ゲルトレイが反ってませんか?
ゲルを高温のまま注ぐとトレイが反ってきます。この状態のトレイを工夫せずにセットするとコームが底に当たり、穴が空きます。

このような場合はゲルを注いだ後にトレイをチップなどで台に押し付けて、全面を密着させる方法があります。
トレイを新しく買うのが一番ですが。

アガロースゲル電気泳動のウェルの漏れ 削除/引用
No.3968-1 - 2015/03/27 (金) 16:17:29 - TS
いつも勉強させてもらっています。

DNAのアガロースゲル電気泳動ですが、
時々、ロードしたサンプルがウェルの底から漏れてしまう現象に会います。

この現象は、みなさまには起きませんでしょうか。

サンプルをローディングする時に穴を作ってしまっていることはなく、
おそらくコームを抜くときに亀裂?が入っていると思います。
そうっとコームを抜いているつもりですが、それでもたまに起きてしまいます。

0.5%程度のゲルを作ることが多いです。
アガロースはニッポンジーンのagaroseSを使っています。

もし同様の現象になったことがある人がいて、対策として
気を付けていることなどありましたら教えていただけると助かります。

よろしくお願いします。

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