PCR、real-time PCRでどうやってもコンタミが起きてしまう
恥を忍んで質問させていただきます。
現在、とある病原体2種類の表題試験をそれぞれ担当しています。
病原体@に関しては一昨年度から継続して試験をしているものの、半年ほど前からPCR、qPCR(SYBR Green)ともにD.W.でも目的サイズにバンドが検出されるようになりました。
まずはコンタミを疑い、試薬・水・プライマーをすべて新調し、オートクレーブしたtubeとフィルターチップを使用してキャビネット内でゴム手袋を着用して作業をするようにしましたが改善されませんでした。次にプライマー業者を変更し、その病原体を扱っていない実験室に作業を移したものの結果は変わりませんでした。
そこで病原体@の検出用プライマーを他の論文を参照して新たに3セット作ってみたものの、そのすべてでやはりD.W.でも陽性となり、嫌気がさして解決せずに問題を放置していました。
今回、病原体Aの定量系を立ち上げるように指示を受け、前回の病原体@の時のようなコンタミなのか非特異的増幅なのか訳の分からない現象(結果から判断してコンタミだと思いますが…)になやまされることのないように、TaqManの系でMGBプローブを使った実験系を組みました。
…が、昨日qPCRしたものの、D.W.や陰性サンプルでも10~100コピー程度の検出があり、産物を泳動して確認するとばっちり太いバンドが出ていました。
病原体@とAは宿主動物こそ同じもののまったく異なる生物です。
プライマーはすべて既出論文を参考としていて、非特異はないと報告されているものを使用しています。
全てにおいて泳動したときのバンドはぴったりそれぞれの目的産物(70~270bp)の位置に検出されていますが、シーケンスは機器がないためしていません。ですが、すべての正しいサイズに検出されるのでシーケンスするまでもないと思っています。
上司にも作業を一部始終見てもらってもダメで、誰かに嫌がらせを受けている可能性まで考えて自分以外が試薬をあけた場合はわかりようにし、水も毎回アンプルをあけて使っています。
当方、学生時代もあわせると10年近くこの分野で研究しておりますが、そもそもPCR,qPCRでコンタミが疑われるようなことが起きたのは初めてで、これほど神経質にやってるのに正直お手上げです。
愚痴交じりの投稿で申し訳御座いませんが、思い当たる経験がおありでしたらアドバイスお願い致します。
|
|
このスレッドをはてなブックマークに追加